Apresenta técnicas adotadas para avaliação da qualidade do sêmen, uma que seja de alta precisão, de simples adoção e que não requeira treinamento especializado, favorecendo as atividades de veterinários e de criadores de ovinos.bitstream/CNPC/20247/1/cot71.pd

ELOY, A. M. X.

FURTADO, J. R.

Apresenta técnicas adotadas para avaliação da qualidade do sêmen, uma que seja de alta precisão, de simples adoção e que não requeira treinamento especializado, favorecendo as atividades de veterinários e de criadores de ovinos

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Teste de Avaliação do Meta-bolismo Espermático emOvinosAngela Maria Xavier Eloy1João Ricardo Furtado21Med. Vet., Ph. D., Embrapa Caprinos. Estrada Sobral/Groaíras, Km 04, Caixa Postal 145,CEP 62010-970 - Sobral/CE. Email: angela@cnpc.embrapa.br2Assistente de pesquisa, Embrapa Caprinos. E-mail: ricardo@cnpc.embrapa.br71ISSN 1676-7675Sobral, CEDezembro, 2006ComunicadoTécnicoOn lineEmbora várias técnicas analíticas tenham sido desenvolvi-das para avaliar a qualidade espermática (concentração,motilidade, viabilidade e morfologia), não há em usorotineiro um teste simples que proporcione informaçãocompleta sobre a qualidade do sêmen.Algumas avaliações espermáticas utilizadas rotineiramenteno Brasil levam em consideração testes subjetivos, quesão fadados a equívocos, levando, portanto, a diagnósti-cos imprecisos, além de exigirem uma capacitação técnicamais refinada.Testes mais precisos e de fácil realização são necessáriospara a seleção de animais em programas de melhoramentogenético e, especialmente, para aqueles cujo sêmen sedestina à congelação.O Resazurin (7-hidroxi-3H-fenoxazin-3-one 10-óxido), queé um corante metabólico, foi usado inicialmente paradetectar  bactérias no leite (1945) e, posteriormente,utilizado por Erb & Ehlers (1950) para testar sêmenbovino. Desde a década de 90, vem sendo empregadocom sucesso na previsão da fertilidade em várias espécies,inclusive em humanos.Pretendeu-se, com este comunicado técnico, apresentardentre as técnicas adotadas para avaliação da qualidade dosêmen, uma que seja de alta precisão, de simples adoção eque não requeira treinamento especializado, favorecendoas atividades de veterinários e de criadores de ovinos.Princípio doResazurin Teste(REZt) O desempenho reprodutivo depende de processosmetabólicos,  portanto, o acesso ao status metabólico doespermatozóide poderá proporcionar informações valiosassobre a capacidade fertilizante do sêmen.Trabalhos mostram uma correlação do REZt com a concen-tração de adenosina trifosfato (ATP) no sêmen de huma-nos, espécie na qual os estudos estão mais avançados.Autores mencionam que a precisão e o valor prognósticoid22221906 pdfMachine by Broadgun Software  - a great PDF writer!  - a great PDF creator! - http://www.pdfmachine.com  http://www.broadgun.com 2 Teste de avaliação do metabolismo espermático em ovinosdo teste são similares aos dos mais sofisticados métodosde determinação do ATP.Os organismos vivos, animais e plantas, requerem umsuprimento contínuo de energia para exercerem suasfunções. Essa energia é usada em todos os processos paraa manutenção do organismo vivo. Alguns processosacontecem continuamente, tais como o metabolismo dosalimentos, a síntese de importantes moléculas, comoproteínas e DNA, e o transporte de moléculas e íonsatravés do organismo. Outros acontecem somente emdeterminado período, como a contração muscular e outrosmovimentos celulares.Os animais obtêm energia através da oxidação dos alimen-tos, e as plantas através da luz do sol por meio da clorofila.Contudo, antes de ser  utilizada,  a energia  se transforma,de modo que o organismo possa usá-la facilmente. Estetransportador de energia é a molécula de ATP.O ATP consiste de um nucleotídeo (com o açúcar ribose) etrês grupos de fosfato, que é utilizado pelo organismoatravés da ação de uma enzima (Fig. 1). Essa reação liberaenergia que poderá ser usada para a formação de proteí-nas, contração muscular, etc. Como produto, forma-se aadenosina difosfato (ADP) e o grupo fosfato tanto  terminacomo ortofosfato (HP) 4 ou se liga a outra molécula. Semais energia for extraída pela remoção do segundo grupofosfato, há a produção da adenosina monofosfato (AMP). O Resazurin teste (REZt) proporciona uma avaliação dometabolismo do espermatozóide ativo, mostrando visual-mente uma mudança de cor durante determinado tempo. Aatividade da desidrogenase espermática é manifestada pelavariação da cor azul (resazurin) para róseo (resofurin) e, emseguida, para branco (diidroresorufin).Pesquisas têm apresentado resultados promissores comrelação ao REZt em várias espécies.  Em bovinos, obser-vou-se alta correlação entre o teste e a taxa de  fertilidade.Em ovinos e suínos tem se observado uma correlação coma qualidade do sêmen. Pesquisas também tentamcorrelacionar o Resazurin teste com a concentraçãoespermática de espermatozóides vivos.  Nesse contexto, atécnica usada por Martin et al. (1999) (3,1 mg deresazurin (0,9%) por 0,5 ml de amostra, revelou, emovinos, que o REZt foi capaz de predizer o número mínimode espermatozóides móveis. Portanto, vários trabalhosforam realizados determinando-se a concentração mínimade espermatozóides capaz de desencadear a redução dacor de azul para róseo em x tempo e a concentraçãomínima capaz de não provocar a reação.Resazurin Teste  - ATécnicaVárias metodologias são utilizadas para avaliação dosêmen através do Resazurin. Algumas usam oespectrofotômetro para melhor mensurar a variação de cor;outras técnicas realizam o teste observando a variação aolho nu, sem auxílio de equipamentos; existem as quediluem o sêmen, etc.O objetivo deste trabalho foi eleger uma técnica simples,sem o auxílio do espectrofotômetro e sem a necessidadede diluir o sêmen a ser avaliado, capaz de determinar aqualidade do sêmen através da predição da concentraçãode espermatozóides ativos/mL.O sêmen de seis reprodutores ovinos foi coletado, quinze-nalmente,  perfazendo um total de cinqüenta amostras, eforam avaliadas características como aspecto, volume (mL),e concentração total de espermatozóides (x109) e concen-tração de espermatozóides ativos (x109) através deespectrofotômetro.Várias técnicas foram utilizadas, entre elas a de Dart et al.(1994), Mahmoud et al.(1994), Zalata et al. (1998),Martin et al. (1999) e Foote (1999). A técnica de Dart etal. (1994) foi a escolhida em virtude da simplicidade e dosresultados obtidos. Portanto, utilizando-se esse método,adicionou-se 8,8 mg de Resazurin (0,9% em soluçãosalina) por mL de sêmen, homogeneizou-se a amostra eteve início o período de incubação a 37 ° C (Fig. 2). Aobservação da reação foi realizada a cada quinze segun-dos, imediatamente após a homogeneização, e teveduração de quinze minutos. Como exemplo, a Fig. 3 mostra o início da alteração decor do azul para o róseo. Vale mencionar que essa figuraretrata o experimento no qual observou-se que as amostras1 e 2 apresentaram redução dentro de dez segundos, comFig. 1. Esquema gráfico da liberação de energia da molécola de ATPFonte: IRCC, 2006AdenosinaRiboseAdenosinaAMP (Adenosina monofosfato)ADP (Adenosina difosfato)ATP (Adenosina triposfato3Teste de avaliação do metabolismo espermático em ovinosconcentração espermática ativa acima de 1,4 x 109espermatozóides, enquanto a amostra 3, com concentra-ção abaixo de 1,4 x 109  demorou mais de quinze minu-tos. O tempo despendido para redução do azul para oróseo e deste para o branco, revela a capacidade metabóli-ca dos espermatozóides e sua relação com a qualidade dosêmen. A Fig. 4 mostra a redução do resofurin (róseo)para diidroresofurin (branco), que também é um indicativoda concentração de ATP nas células ativas.  Com essasobservações, conclui-se que as amostras 1 e 2 apresentammaior quantidade de ATP nas células espermáticas econcentração de espermatozóides ativos acima de 1,4 x109. Por conseguinte, esses espermatozóides apresentammaior capacidade fertilizante (amostras 1 e 2) do que aamostra 3, embora tenham apresentado mesma motilidadeprogressiva inicial na análise pós-colheita.Concentração de Resofurin Diidroresofurinespermatozóides (min) (min)vivos (x 109)< 1,4 > 1 > 7,5> 1,4 <1 < 6,0De acordo com as observações feitas, as amostras desêmen que apresentaram redução do azul para o róseodentro de sessenta segundos, apresentam melhor metabolis-mo e qualidade espermáticas. Adicionalmente, em outroteste, observou-se que alguns animais apresentaram um altoescore de motilidade progressiva individual na primeiraleitura (90) com vigor 4 e, no REZt, ultrapassou os 60segundos para mudar a coloração. Realizou-se então, após30 minutos, a segunda leitura, que mostrou uma quedaacentuada na motilidade, corroborando com os resultadosdo teste.De acordo com os achados do presente trabalho e corrobo-rando com os de Martin et al., (1999), sugere-se a seguinteproposição para avaliação do sêmen através do REZt:Considerações FinaisTendo em vista a necessidade de disponibilizar um testeviável, de fácil operacionalização, podendo ser realizado acampo,  eficiente em seus princípios, e que, principalmentenão seja subjetivo e assegure o menor erro possível,propõe-se a utilização do REZt como um teste complemen-tar ou opção de avaliação da capacidade espermática paraseleção de reprodutores  ovinos.Literatura ConsultadaCOOPER, T. A.; WANG, S.; LIU, Y.; BUNCH, T. D.;HOLYOAK, G. R. A new method to evaluate the viabilityofcryopreserved ram semen using a resazurin reductionassay. Theriogenology. v. 45, p. 313, 1996.DART, M. G.; MESTA, J.; CRESHAW, C.; ERICSSON, S.A. Modified resazurin reduction test for determining thefertility potential of bovine spermatozoa. Archives ofAndrology, v. 33, p. 71-75, 1994.ERB, R. E.; EHLERS, F. H. Resazurin reducing times as naindicator of semen fertilizing capacity. Journal of DairyScience, v. 32, p. 853, 1950.FOOTE, R. H. Resazurin reduction and other tests ofsemen quality and fertility of bulls. Asian Journal ofAndrology, v. 1, p. 109-114, 1999.Fig. 2. Início da redução do Resazurin exibindo coloração azul.Fig. 3. Redução do Resazirun para resofurin com diferentes reações durentemesmo período de tempo em três ovinos da raça Santa Inês.Fig. 4. Reação após 15 minutos de incubação, apresentando o retorno doróseo para o branco em três ovinos da raça Santa Inês.4 Teste de avaliação do metabolismo espermático em ovinosExemplares desta edição podem ser adquiridos na:Embrapa CaprinosEndereço: Estrada Sobral/Groaíras, Km 04 - CaixaPostal 145, CEP 62010-970  Sobral, CEFone: (0xx88) 3677-7000Fax: (0xx88) 3677-7055Home-page: www.cnpc.embrapa.brE-mail: www.cnpc.embrapa.br/sac.htm1a edição On line (dez./2006)Presidente: Diônes Oliveira dos SantosSecretária-Executiva: Luciana Cristine Vasques VillelaMembros: Alexandre César Silva Marinho  Verônica Vasconcelos Freire  Marcelo Renato Alves Araújo  Tânia Maria Chaves CampêloSupervisor editorial: Alexandre César Silva MarinhoRevisão de texto: José Carlos Mendes VasconcelosNormalização bibliográfica: Alexandre C. S.  MarinhoEditoração eletrônica: Alexandre César Silva MarinhoComitê depublicaçõesExpedienteComunicadoTécnico, 71On LineGOV ERNO FEDERA LGLASS, R. H.; ERICSSON, S. A.; ERICSSON, R. J.; DROUIN, M. T.; MARCOUX, L.J.; SULLIVAN, H. The resazurinreduction teste provides na assessment of sperm activity. Fertility and Sterility, v. 56, p. 743-6, 1991.HOLT, W. V.; MEDRANO, A. Assessment of boar sperm function in relation to freezing and storage. Journal ofReproduction and Fertility, v. 52, p. 213-222, 1997.MAHMOUD, A. M.; COMHAIRE, F. H.; VERMEULEN, L.; ANDREOU, E. Comparison of the resazurin test, adenosinetriphosphate in semen, and various sperm parameters. Human Reproduction, v. 9, p. 1688-1693, 1994.MARTIN, L. M.; CRENSHAW, C. C.; DEAN Jr., J. A.;  DART, M. G.; PURDY, P. H.; ERICSSON, S. A. Detarmination ofthe number of motile sperm within na ovne semen sample using resazurin. Small Ruminant Research, v. 32, p. 161-165,1999.REDDY, K. V.; MEHERJI, P. K.; GOKRAL, J. S.; SHAHANI, S. K. Resazurin reduction test to evaluate semen quality.Indian Journal of Experimental Biology, v. 35, p. 369-373, 1997.ZALATA, A. A.; LAMMERTIJN, N.; CHRISTOPHE, A.; COMHAIRE, F. H. 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Teste de avaliação do metabolismo espermático em ovinos.

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