Neste comunicado, são relatadas todas as informações necessárias para a determinação da atividade antioxidante total em frutas no sistema beta-caroteno/ácido linoléico, baseadas em adaptações/modificações feitas nos laboratórios da Embrpa Agroindústria Tropical.bitstream/CNPAT-2010/11963/1/cot-126.pd

ALVES, R. E.

BRITO, E. S. de

MANCINI FILHO, J.

MOREIRA, A. V. B.

RUFINO, M. do S. M.

Neste comunicado, são relatadas todas as informações necessárias para a determinação da atividade antioxidante total em frutas no sistema beta-caroteno/ácido linoléico, baseadas em adaptações/modificações feitas nos laboratórios da Embrpa Agroindústria Tropical

Infoteca-e

126ISSN 1679-6535Dezembro, 2006Fortaleza, CEMaria do Socorro Moura Rufino1Ricardo Elesbão Alves2Edy Sousa de Brito3Jorge Mancini Filho4Ana Vládia Bandeira Moreira5Foto: Maria do Socorro M. Rufino1 Engenheira Agrônoma, M. Sc., Bolsista da CAPES, Doutoranda, UFERSA, BR 110, Km 47, 59625-900, Mossoró, RN, marisrufino@yahoo.com.br2 Engenheiro Agrônomo, D. Sc. em Pós-Colheita, Pesquisador da  Embrapa Agroindústria Tropical, R. Dra. Sara Mesquita, 2270, Pici, 60511-110, Fortaleza, CE,elesbao@pesquisador.cnpq.br3Químico Industrial,  D. Sc. em Tecnologia de Alimentos, Pesquisador da Embrapa Agroindústria Tropical, edy@cnpat.embrapa.br4 Farmacêutico Bioquímico, Ph. D., Professor Titular, USP, Av. Prof. Lineu Prestes, 580, Bloco 14, Butantã, 05508-900, São Paulo, SP, jmancini@usp.br5 Nutricionista, D. Sc., Professora Adjunta I, UFRN, Av. Cordeiro de Farias, s/n, Petrópolis, 59100-180 Natal, RN, ana.vladia@terra.com.brMetodologia Científica:Determinação da AtividadeAntioxidante Total em Frutasno Sistema β-caroteno/ÁcidoLinoléicoIntroduçãoUma das maiores alterações que ocorrem durante oprocessamento, distribuição, armazenamento epreparo dos alimentos é a oxidação. E a oxidaçãolipídica se destaca, pois pode afetar a qualidadenutricional, segurança, cor, sabor, aroma e texturados alimentos. As reações oxidativas, além de produ-zirem diminuição no valor nutricional dos alimentos,são também responsáveis pela formação de compos-tos potencialmente tóxicos e antinutricionais para oorganismo humano e animal (Kanazawa et al., 1985;Shahidi & Wanansundara, 1992).Existem substâncias com propriedades antioxidantesutilizadas no processamento de óleos e gorduras e nosalimentos que, em geral, são capazes de retardar aoxidação lipídica (Moreira & Mancini Filho, 2003). Osantioxidantes podem ser naturais, como ácidoascórbico, α-tocoferol e compostos fenólicos presen-tes nos alimentos, ou sintéticos, como 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilchroman-2-ácido carboxílico (Trolox),hidroxianisol butilado (BHA) e hidroxitolueno butilado(BHT). Dentre estes, Trolox é o composto sintéticomais utilizado, por ser um análogo da vitamina E e serde natureza hidrossolúvel.Os antioxidantes sintéticos estão restritos a ummáximo de 200 mg/kg pelos códigos bromatológicosde diversos países, e têm sido freqüentementemonitorados devido a possíveis danos que eles podemvir a provocar no organismo (Babich, 1992).Componentes como o β-caroteno agem inibindo ooxigênio singleto e interagem sinergicamente com avitamina E, para inibir a peroxidação lipídica. Outrosconstituintes fenólicos em alimentos, tais como osflavonóides, podem também reduzir os danos causa-dos pelo estresse oxidativo (Schwenke, 1998).O sistema β-caroteno/ácido linoléico foi desenvolvidopor Marco (1968), modificado por Miller (1971) e2 Metodologia Científica: Determinação da Atividade Antioxidante Total em Frutas no Sistema β-caroteno/Ácido Linoléicoutiliza o ácido linoléico, monopalmitato de polioxietilenosorbitan (Tween 40) e o β-caroteno. Trata-se de umensaio espectrofotométrico baseado na oxidação(descoloração) do β-caroteno induzida pelos produtosda degradação oxidativa do ácido linoléico (Silva et al.,1999), ou seja, o método avalia a atividade de inibiçãode radicais livres gerados durante a peroxidação doácido linoléico (Duarte-Almeida et al., 2006).Neste comunicado, são relatadas todas as informa-ções necessárias para a determinação da atividadeantioxidante total em frutas no sistema β-caroteno/ácido linoléico, baseadas em adaptações/modificaçõesfeitas nos laboratórios da Embrapa AgroindústriaTropical.2. Materiais NecessáriosReagentes• β-Caroteno - Merck, código 01111324, ou equivalente.• Acetona P.A.• Ácido linoléico - Acros organics, código 01111322,ou equivalente.• Água destilada• Álcool etílico P.A.• Álcool metílico P.A.• Clorofórmio• Trolox (PM = 250,29) – Sigma, código 218940050,ou equivalente.• Tween 40Equipamentos e Vidrarias• Agitador de tubos de ensaio• Balança analítica• Balão volumétrico 100 mL e 1.000 mL• Banho-maria• Becker 25 mL e 100 mL• Cronômetro digital• Cubetas de vidro (4 x 1 cm)• Erlenmeyer 250 mL• Espectrofotômetro• Oxigenador• Pipeta automática (10 – 1.000 µL)• Proveta de 50 mL• Tubos de 2 mL• Tubos de ensaio com tampa rosqueada (18 mL)Preparo de SoluçõesSolução de Álcool Metílico a 50%Em balão volumétrico de 1 L, adicionar 500 mL deálcool metílico; completar o volume para 1.000 mLcom água destilada, homogeneizar e transferir para umfrasco de vidro devidamente etiquetado. Armazenarem temperatura ambiente por tempo indeterminado.Solução de Acetona a 70%Em balão volumétrico de 1 L, adicionar 700 mL deacetona; completar o volume para 1.000 mL com águadestilada, homogeneizar e transferir para um frasco devidro devidamente etiquetado. Armazenar em tempe-ratura ambiente por tempo indeterminado.Solução Controle de Trolox 200 mg/LDissolver 2 mg de Trolox em aproximadamente 5 mLde álcool etílico e completar o volume para 10 mL emum balão volumétrico com álcool etílico, homogeneizare transferir para um frasco de vidro âmbar devidamen-te etiquetado. Preparar e usar apenas no dia daanálise. Nos testes realizados em laboratório, foiconstatado que a concentração de 200 mg/L de Troloxé a que proporciona a maior proteção ao sistema,quando comparada a outras (Fig. 1), sugerindo-se,portanto, o seu uso.Tratamento da Água DestiladaSubmeter aproximadamente 500 mL de água destiladaa borbulhamento com  oxigênio (oxigenador) por 30minutos.Solução β-Caroteno 20 mg/mLPesar 20 mg de β-caroteno em um tubo de 2 mL,protegido da luz com papel alumínio, adicionar  1 mLde clorofórmio, agitar e utilizar imediatamente.Solução Sistema β-caroteno/ÁcidoLinoléicoEm um erlenmeyer, adicionar 40 µL de ácido linoléico,530 µL de Tween 40, 50 µL da solução β-caroteno e,para solubilizar, adicionar 1 mL de clorofórmio,homogeneizar e, posteriormente, evaporar o clorofór-mio com o auxílio do oxigenador. Em seguida, adicionara água tratada com oxigênio até obter uma3Metodologia Científica: Determinação da Atividade Antioxidante Total em Frutas no Sistema β-caroteno/Ácido Linoléicoabsorbância entre 0,6 nm e 0,7 nm a 470 nm.  Asolução sistema apresenta uma coloração amarelo-alaranjada (Fig. 2); deve ser sempre protegida da luz eprontamente utilizada.Fig. 1. Atividade antioxidante de diferentes concentrações de trolox no sistema β-caroteno/ácido linoléico.Fig. 2. Solução β-caroteno/ácido linoléico.Protocolo do Métodoβ-caroteno/Ácido LinoléicoObtenção dos Extratos da FrutaEste procedimento foi adaptado de Larrauri et al.(1997). Como a concentração de compostosantioxidantes varia de fruta para fruta, fazem-senecessários testes prévios. Em análises realizadas noLaboratório de Fisiologia e Tecnologia Pós-Colheita, daEmbrapa Agroindústria Tropical, com diferentesfrutas, têm-se utilizado de 1 g a 25 g de amostra, deacordo com a fruta. Pesar a amostra em um béquer de100 mL, adicionar 40 mL de metanol 50%,homogeneizar e deixar em repouso por 60 minutos àtemperatura ambiente. Centrifugar a 25.406,55 g(15.000 rpm) durante 15 minutos, transferir osobrenadante para um balão volumétrico de 100 mL. Apartir do resíduo da primeira extração, adicionar 40 mLde acetona 70%, homogeneizar e deixar em repousopor 60 minutos à temperatura ambiente. Centrifugarnovamente a 25.406,55 g (15.000 rpm) durante 15minutos, transferir o sobrenadante para o balãovolumétrico contendo o primeiro sobrenadante ecompletar o volume para 100 mL com água destilada.Determinação da Atividade AntioxidanteTotal (AAT)A partir do extrato obtido no item anterior, prepararem tubos de ensaio, no mínimo três diluições diferen-tes, em triplicata. Misturar 0,4 mL de cada diluição doextrato com 5 mL da solução sistema (item soluçãosistema β-caroteno/ácido linoléico). Utilizar comocontrole 0,4 mL da solução de trolox (item soluçãocontrole de trolox 200 mg/L) com 5 mL da soluçãosistema β-caroteno/ácido linoléico, homogeneizar ostubos de ensaio em agitador e manter em banho-mariaa 40 °C. Realizar a primeira leitura (470 nm) após 2minutos de efetuada a mistura e depois em intervalosde quinze minutos até 120 minutos. Oespectrofotômetro deve ser calibrado com água.00,10,20,30,40,50,60,70,80 15 30 45 60 75 90 105 120Tempo (min)Absorbância(470nm)sistema200 mg/L100 mg/L50 mg/L25 mg/LFoto: Maria do Socorro M. Rufino4 Metodologia Científica: Determinação da Atividade Antioxidante Total em Frutas no Sistema β-caroteno/Ácido LinoléicoExemplares desta edição podem ser adquiridos na:Embrapa Agroindústria TropicalEndereço: Rua Dra. Sara Mesquita 2270, Pici,CEP 60511-110 Fortaleza, CEFone: (0xx85) 3299-1800Fax: (0xx85) 3299-1803 / 3299-1833E-mail: negocios@cnpat.embrapa.br1a edição on line: dezembro de 2006Comitê dePublicaçõesExpedienteComunicadoTécnico, 126Presidente: Francisco Marto Pinto VianaSecretário-Executivo: Marco Aurélio da Rocha MeloMembros: Janice Ribeiro Lima, Andréa Hansen Oster,Antonio Teixeira Cavalcanti Júnior, José JaimeVasconcelos Cavalcanti, Afrânio Arley TelesMontenegro, Ebenézer de Oliveira Silva.Supervisor editorial: Marco Aurélio da Rocha MeloRevisão de texto: José Ubiraci AlvesEditoração eletrônica: Arilo Nobre de OliveiraNormalização bibliográfica: Ana Fátima Costa Pinto.Ministério daAgricultura, Pecuáriae AbastecimentoO decréscimo da leitura da absorbância das amostrasé correlacionado com o sistema e estabelece apercentagem de oxidação (Eq. 2), subtraindo-se apercentagem de oxidação de cada amostra de 100(Eq. 3). Verifica-se a ação antioxidante da amostra(fruta), comparando-a com a atividade do antioxidantesintético (trolox).AgradecimentosAo Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico eTecnológico (CNPq) e à União Européia pelo apoiofinanceiro - Projetos “Atividade antioxidante de frutasdo Nordeste brasileiro como fator de Proteção daSaúde” – CNPq Edital CT-Saúde/MCT/MS 030/2004 –Processo 506.633/2004-7 e “Producing added valuefrom under-utilised tropical fruit crops with highcommercial potential” - Sixth Framework Programme– Contrato 0015279, respectivamente.ReferênciasBABICH, H. Butylated hydroxytoluene (BHT): a review.Environmental Research, v.29, p.1-29, 1992.DUARTE-ALMEIDA, J.M.; SANTOS, R.J.; GENOVESE, M.I.;LAJOLO, F.M. Avaliação da atividade antioxidante utilizandosistema b-caroteno/ácido linoléico e método de seqüestro deradicais DPPH. Ciência e Tecnologia de Alimentos, v.26, n.2,p.446-452, 2006.KANAZAWA, K.; KANAZAWA, A.E.; NATAKE, M. 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