ALVES, R. E.

BRITO, E. S. de

MORAIS, S. M. de

PÉREZ - JIMÉNEZ, J.

RUFINO, M. do S. M.

SAMPAIO, C. de G.

SAURA-CALIXTO, F. D.

Infoteca-e

ISSN 1679-6535Julho, 2007Fortaleza, CEMaria do Socorro Moura Rufino1Ricardo Elesbão Alves2Edy Sousa de Brito3Selene Maia de Morais4Caroline de Goes Sampaio5Jara Pérez-Jiménez6Fulgencio Diego Saura-Calixto7Foto: Maria do Socorro M. Rufino1 Engenheira Agrônoma, M. Sc., Bolsista da CAPES, Doutoranda, UFERSA, BR 110, Km 47, 59625-900, Mossoró, RN, marisrufino@yahoo.com.br2 Engenheiro Agrônomo, D. Sc. em Pós-Colheita, Pesquisador da  Embrapa Agroindústria Tropical, R. Dra. Sara Mesquita, 2270, Pici, 60511-110, Fortaleza, CE,elesbao@pesquisador.cnpq.br3 Químico Industrial,  D. Sc. em Tecnologia de Alimentos, Pesquisador da Embrapa Agroindústria Tropical, edy@cnpat.embrapa.br4 Química Industrial, Ph. D., Professora Titular, UECE, Av. Paranjana, 1700, Campus do Itaperi, 60740-000, Fortaleza, CE, selene@uece.br;5 Graduanda em Química, Bolsista CNPq, UECE6 Licenciada em Ciência e Tecnologia dos Alimentos, Doutoranda/I3P-CSIC, Departamento de Metabolismo y Nutrición, Instituto del Frío, CSIC, Ciudad Universitaria,José Antonio Novais, 10, 28040, Madri, Espanha7 Licenciado em Ciências Químicas, Professor, Pesquisador, D. Sc., CSIC. fsaura@if.csic.esMetodologia Científica:Determinação da AtividadeAntioxidante Total em Frutaspela Captura do Radical LivreDPPHIntroduçãoAntioxidante é um composto que protege o sistemabiológico contra o efeito nocivo de processos oureações que podem causar oxidação excessiva(KRINSKY, 1994). Evidências epidemiológicas crescen-tes do papel de alimentos antioxidantes na prevençãode certas doenças têm conduzido ao desenvolvimentode grande número de métodos para determinar acapacidade antioxidante (PÉREZ-JIMÉNEZ e SAURA-CALIXTO, 2006). Estes métodos podem ser baseadosna captura do radical peroxila (ORAC, TRAP), poder deredução do metal (FRAP; CUPRAC), captura do radicalhidroxila (método de desoxirribose), captura do radicalorgânico (ABTS, DPPH), quantificação de produtosformados durante a peroxidação de lipídios (TBARS,oxidação do LDL, co-oxidação do -caroteno)(FRANKEL e MEYER, 2000; SÁNCHEZ-MORENO,2002; ARUOMA, 2003), etc. Dentre estes métodos,ABTS, FRAP, DPPH e ORAC são alguns dos maisusados atualmente (PÉREZ-JIMÉNEZ e SAURA-CALIXTO, 2006).O método DPPH (BRAND-WILLIAMS et al., 1995) ébaseado na captura do radical DPPH (2,2-difenil-1-picril-hidrazil) por antioxidantes, produzindo um decrés-cimo da absorbância a 515 nm. Esse método foimodificado por SÁNCHEZ-MORENO et al. (1998) paramedir os parâmetros cinéticos.O DPPH é um radical livre que pode ser obtido diretamen-te por dissolução do reagente em meio orgânico (Fig. 1).Neste comunicado são relatadas todas as informaçõesnecessárias para a determinação da atividadeantioxidante total em frutas pela captura do radicalDPPH, baseadas em adaptações / modificações feitasnos laboratórios da Embrapa Agroindústria Tropical.2 Metodologia Cient íf ica: Determinação da At ividade Ant ioxidante Total em Frutas pela Captura do Radical Livre DPPHN N  NO2O2NO2NN N NO2O2NO2NRR  +cor: violeta-escura                           cor: violeta-claraIlustração: Edy Sousa de BritoFig. 1. Estabilização do radical livre DPPH.Materiais NecessáriosReagentesAcetona P.A.Ácool metílico P.A.Água destiladaDPPH (2,2-Diphenyl-1-picryl-hidrazil) (PM = 394,3) -Sigma, código 095K1452, ou equivalenteEquipamentos e vidrariasAgitador de tubos de ensaioBalança analíticaBalão volumétrico 100 mL e 1.000 mLCronômetro digitalCubetas de vidro (4 x 1 cm)EspectrofotômetroPipeta automática (10  1000 µL)Proveta de 50 mLTubos de ensaio com tampa rosqueada (8 mL)Preparo de SoluçõesSolução de álcool metílico a 50%Em balão volumétrico de 1 L, adicionar 500 mL deálcool metílico. Completar o volume para 1.000 mLcom água destilada, homogeneizar e transferir para umfrasco de vidro, devidamente etiquetado. Armazenarem temperatura ambiente por tempo indeterminado.Solução de acetona a 70%Em balão volumétrico de 1 L, adicionar 700 mL deacetona. Completar o volume para 1.000 mL comágua destilada, homogeneizar e transferir para umfrasco de vidro, devidamente etiquetado. Armazenarem temperatura ambiente por tempo indeterminado.Solução controle de álcool metílico,acetona e águaEm balão volumétrico de 100 mL, adicionar 40 mL dasolução de álcool metílico 50% (item solução deálcool metílico a 50% ) e 40 mL da solução de acetona70% (item anterior). Completar o volume para 100 mLcom água destilada, homogeneizar e transferir para umfrasco de vidro, devidamente etiquetado. Armazenarem temperatura ambiente por tempo indeterminado.Solução de DPPH 0,06 mMDissolver 2,4 mg de DPPH em álcool metílico e com-pletar o volume para 100 mL em um balão volumétricocom álcool metílico, homogeneizar e transferir para umfrasco de vidro âmbar, devidamente etiquetado.Preparar e usar apenas no dia da análise.Curva do DPPHPreparo das soluçõesA partir da solução inicial de DPPH (60 M), prepararem balões volumétricos de 10 mL, soluções variando aconcentração de 10 M a 50 M conforme a Tabela 1.Solução de Álcool ConcentraçãoDPPH (mL) metílico (mL) final de DPPH ( M)0 1 0 01,7 8,3 1 03,3 6,7 2 05,0 5,0 3 06,7 3,3 4 08,3 1,7 5 01 0 0 6 0Tabela 1. Preparo das soluções para curva do DPPH.3Metodologia Cient íf ica: Determinação da At ividade Ant ioxidante Total em Frutas pela Captura do Radical Livre DPPHDeterminação da curva do DPPHEm ambiente escuro, transferir uma alíquota de,aproximadamente, 4 mL de cada solução de DPPH(10 µM, 20 µM, 30 µM, 40 µM, 50 µM e 60 µM) paracubetas de vidro e realizar a leitura em espectrofo-tômetro a 515 nm. Utilizar álcool metílico, comobranco, para calibrar o espectrofotômetro.Plotar as concentrações de DPPH ( M) no eixo X e asrespectivas absorbâncias no eixo Y (Fig. 2) e calcular aequação da reta.y = 0,0134x - 0,0155R2 = 0,998700,10,20,30,40,50,60,70,80 10 20 30 40 50 60Concentrações de DPPH (uM)Absorbância (515 nm)Fig. 2. Exemplo de curva do DPPH x absorbância.Protocolo do Método DPPHObtenção dos extratos da frutaEste procedimento foi adaptado de Larrauri et al.(1997). Como a concentração de compostosantioxidantes varia de fruta para fruta, fazem-senecessários testes prévios. Nas análises realizadas noLaboratório de Fisiologia e Tecnologia Pós-Colheita, daEmbrapa Agroindústria Tropical, com diferentes frutas,têm-se utilizado de 1 g a 25 g de amostra, de acordocom a fruta. Pesar a amostra em um béquer de 100 mL,adicionar 40 mL de metanol 50% homogeneizar edeixar em repouso por 60 minutos à temperaturaambiente. Centrifugar a 25.406,55 g (15.000 rpm)durante 15 minutos, transferir o sobrenadante para umbalão volumétrico de 100 mL. A partir do resíduo daprimeira extração, adicionar 40 mL de acetona 70%,homogeneizar e deixar em repouso por 60 minutos àtemperatura ambiente. Centrifugar novamente a25.406,55 g (15.000 rpm) durante 15 minutos,transferir o sobrenadante para o balão volumétricocontendo o primeiro sobrenadante e completar ovolume para 100 mL com água destilada.Determinação da atividade antioxidantetotal (AAT)A partir do extrato obtido no item anterior, prepararem tubos de ensaio no mínimo três diluições diferentesem triplicata. Em ambiente escuro, transferir umaalíquota de 0,1 mL de cada diluição do extrato paratubos de ensaio com 3,9 mL do radical DPPH (itemsolução de DPPH 0,06 mM ) e homogeneizar emagitador de tubos. Utilizar 0,1 mL da solução controle(item solução controle de álcool metílico, acetona eágua ) com 3,9 mL do radical DPPH e homogeneizar.Utilizar álcool metílico, como branco, para calibrar oespectrofotômetro. As leituras (515 nm) devem sermonitoradas a cada minuto, onde é observada aredução da absorbância até sua estabilização. Aleitura da absorbância final para o cálculo do EC50 sódeve ser feita após a estabilização da absorbância(tempo EC50). Para experimentos posteriores, comuma mesma fruta, a leitura pode ser feita apenas notempo estabelecido anteriormente (tempo EC50),acompanhado, também, da leitura inicial  do controle.Após a leitura, substituir (Eq. 1) o valor correspondente ametade da absorbância inicial do controle pelo y da equa-ção da curva do DPPH (Fig. 2) para encontrar o consumoem µM DPPH e, em seguida, transformar para g DPPH.Equivalência de controle e DPPHy = ax  b (Eq. 1)(Equação da curva do DPPH representada na Fig. 2),onde:y = Absorbância inicial do controle / 2 (item determi-nação da atividade antioxidante total )x = resultado em µM DPPHObs.: converter para g DPPH, através da transformação:g DPPH = (µM DPPH / 1.000.000) *  394,3 (pesomolecular do DPPH).A partir das absorbâncias obtidas das diferentesdiluições dos extratos, plotar a absorbância no eixo Y ediluição (mg/L) no eixo X e determinar a equação dareta (Eq. 2). Para calcular a AAT deve-se substituir aabsorbância equivalente a 50 % da concentração doDPPH (item determinação da atividade antioxidantetotal ) pelo y (Eq. 2) e encontrar o resultado quecorresponde à amostra necessária para reduzir em50% a concentração inicial do radical DPPH (EC50).4 Metodologia Cient íf ica: Determinação da At ividade Ant ioxidante Total em Frutas pela Captura do Radical Livre DPPHExemplares desta edição podem ser adquiridos na:Embrapa Agroindústria TropicalEndereço: Rua Dra. Sara Mesquita 2270, Pici,CEP 60511-110 Fortaleza, CEFone: (0xx85) 3299-1800Fax: (0xx85) 3299-1803 / 3299-1833E-mail: negocios@cnpat.embrapa.br1a edição on line: julho de 2007Comitê dePublicaçõesExpedienteComunicadoTécnico, 127Presidente: Francisco Marto Pinto VianaSecretário-Executivo: Marco Aurélio da Rocha MeloMembros: Janice Ribeiro Lima, Andréa Hansen Oster,Antonio Teixeira Cavalcanti Júnior, José JaimeVasconcelos Cavalcanti, Afrânio Arley TelesMontenegro, Ebenézer de Oliveira Silva.Supervisor editorial: Marco Aurélio da Rocha MeloRevisão de texto: José Ubiraci AlvesEditoração eletrônica: Arilo Nobre de OliveiraNormalização bibliográfica: Ana Fátima Costa Pinto.Ministério daAgricultura, Pecuáriae AbastecimentoA partir do resultado (mg/L) encontrado na equação 2,dividir por 1.000 para ter o valor em g e, em seguida,dividir pelo valor encontrado em g DPPH (Eq. 1) paraobter o resultado final (Eq. 3) que é expresso em gfruta (porção comestível) / g DPPH.EC50 expresso em g fruta / g DPPHg fruta / g DPPH = (EC50 (mg/L) / 1.000 *  1) / g DPPHReferênciasARUOMA, O.I. Methodological characterizat ions forcharacterizing potential antioxidant act ions of bioactivecomponents in plant foods. Mutation Research, v.9-20,p.523-524, 2003.BRAND-WILIAMS, W.; CUVELIER, M.E.; BERSET, C. Use of afree radical method to evaluate antioxidant act ivity. FoodScience and Technology, v.28, p.25-30. 1995.FRANKEL, E.N.; MEYER, A.S. The problem of using one-dimensional methods to evaluate mult ifunctional food andbiological antioxidants. Journal of the Science of Food andAgriculture, v.80, p.1925-1941, 2000.KRINSKY, N.I. The biological propert ies of carotenoids. Pureand Applied Chemistry, v. 66, p. 1003-1010, 1994.LARRAURI, J.A.; RUPÉREZ, P.; SAURA-CALIXTO, F. Effect ofdrying temperature on the stabilit ity of polyphenols andantioxidant act ivity of red grape pomace peels. JournalAgriculture and Food Chemistry, v. 45, p. 1390-1393, 1997.PÉREZ-JIMÉNEZ, J.; SAURA-CALIXTO, F. Effect of solventand certain food constituents on dif ferent antioxidant capacityassays. 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Rio de Janeiro: Campus,1995, 168 p.Cálculo do EC50y =  ax + bonde:y = Absorbância inicial do controle / 2 (item determi-nação da atividade antioxidante total )x = EC50 (mg/L).(Eq. 2)AgradecimentosAo Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico eTecnológico (CNPq) e à União Européia, pelo apoiofinanceiro - Projetos Atividade antioxidante de frutasdo Nordeste brasileiro como fator de proteção dasaúde  CNPq Edital CT-Saúde/MCT/MS 030/2004 Processo 506.633/2004-7 e Producing added valuefrom under-utilised tropical fruit crops with highcommercial potential - Sixth Framework Programme -Contrato 0015279, respectivamente.(Eq. 3)

Metodologia científica: determinação da atividade antioxidante total em frutas pela captura do radical livre DPPH.

http://www.infoteca.cnptia.embrapa.br/infoteca/bitstream/doc/426953/1/Cot127.pdf

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