ALVES, R. E.

BRITO, E. S. de

MORAIS, S. M. de

PÉREZ-JIMÉNEZ, J.

RUFINO, M. do S. M.

SAMPAIO, C. de G.

SAURA-CALIXTO, F. D.

Infoteca-e

ISSN 1679-6535Julho, 2007Fortaleza, CEMaria do Socorro Moura Rufino1Ricardo Elesbão Alves2Edy Sousa de Brito3Selene Maia de Morais4Caroline de Goes Sampaio5Jara Pérez-Jiménez6Fulgencio Diego Saura-Calixto7Foto: Maria do Socorro M. Rufino1 Engenheira Agrônoma, M. Sc., Bolsista da CAPES, Doutoranda, UFERSA, BR 110, Km 47, 59625-900, Mossoró, RN, marisrufino@yahoo.com.br2 Engenheiro Agrônomo, D. Sc. em Pós-Colheita, Pesquisador da  Embrapa Agroindústria Tropical, R. Dra. Sara Mesquita, 2270, Pici, 60511-110, Fortaleza, CE,elesbao@pesquisador.cnpq.br3 Químico Industrial,  D. Sc. em Tecnologia de Alimentos, Pesquisador da Embrapa Agroindústria Tropical, edy@cnpat.embrapa.br4 Química Industrial, Ph. D., Professora Titular, UECE, Av. Paranjana, 1700, Campus do Itaperi, 60740-000, Fortaleza, CE, selene@uece.br;5 Graduanda em Química, Bolsista CNPq, UECE6 Licenciada em Ciência e Tecnologia dos Alimentos, Doutoranda/I3P-CSIC, Departamento de Metabolismo y Nutrición, Instituto del Frío, CSIC, Ciudad Universitaria,José Antonio Novais, 10, 28040, Madri, Espanha7 Licenciado em Ciências Químicas, Professor, Pesquisador, D. Sc., CSIC. fsaura@if.csic.esMetodologia Científica:Determinação da AtividadeAntioxidante Total em Frutaspela Captura do Radical LivreABTS +IntroduçãoOs radicais livres do oxigênio, com seus elétrons não-pareados, podem atacar e danificar, praticamente,qualquer molécula encontrada no organismo. São tãoativos que, uma vez formados, ligam-se a diferentescompostos em frações de segundo. Ao fazê-lo, elespodem entregar seu elétron não-pareado ou capturarum elétron de outra molécula, a fim de formar um par.De uma forma ou de outra, os radicais acabam ficandoestáveis, mas a molécula atacada, em si, transforma-se em um radical. Isso inicia uma reação em cadeiaque pode agir destrutivamente sobre um tecido(YOUNGSON, 1995).As espécies reativas do oxigênio são: ânion superóxido(O2·-), radical hidroxila (OH·), oxido nítrico (NO),peróxido de hidrogênio (H2O2), radical lipídico (L·),entre outros. Eles são importantes nos processosbiológicos de produção de energia e fagocitose(BOREK, 1997). Entre as espécies, o radical hidroxila émais reativo na indução de lesões nas moléculascelulares. Além disso, o peróxido de hidrogênio,apesar de não ser considerado um radical livre, écapaz de atravessar a membrana nuclear e induzirdanos à molécula de DNA (ANDERSON, 2000).Renaud et al. (1998) relatam que o interesse dosconsumidores e da comunidade científica em relaçãoaos antioxidantes naturais tem aumentado, particular-mente em relação àqueles encontrados em frutas evegetais, tendo em vista que estudos farmacológicosdemonstram a associação entre o seu consumo e obaixo risco de doenças degenerativas.De acordo com Halliwell (1996), os efeitos defensivosde antioxidantes naturais em frutas e vegetais estãorelacionados a três grandes grupos: ácido ascórbico e2 Metodologia Cient íf ica: Determinação da At ividade Ant ioxidante Total em Frutas pela Captura do Radical Livre ABTS +cor: verde-escura                                      cor: verde-claraIlustração: Edy Sousa de BritoFig. 1. Estabilização do radical ABTS·+  por um antioxidante e sua formação pelo persulfato de potássio.fenólicos como antioxidantes hidrofílicos e carote-nóides como antioxidantes lipofílicos.Um dos métodos mais utilizados para medir a atividadeantioxidante é através da captura do radical 2,2´-azinobis(3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfônico) (ABTS),que pode ser gerado através de uma reação química,eletroquímica ou enzimática (Fig. 1). Com essa metodo-logia, pode-se medir a atividade de compostos de natu-reza hidrofílica e lipofílica (KUSKOSKI et al., 2005).Neste comunicado, são relatadas todas as informaçõesnecessárias para a determinação da atividade antioxi-dante total em frutas pelo método da captura do radicalABTS, baseadas em adaptações/modificações feitasnos laboratórios da Embrapa Agroindústria Tropical.Materiais NecessáriosReagentesABTS (2,2  AZINO  BIS (3-ethylbenzo  thiazoline 6  sulfonic acid) diammoninum salt (PM =548,68) - Sigma, código A1888 ou equivalente.Acetona P.A.Água destiladaÁlcool etílico P.A.Álcool metílico P.A.Persulfato de Potássio (PM = 270,3)  AcrosOrganics, código 202015000 ou equivalente.Trolox (6-Hidroxi-2,5,7,8-tetrametilchroman-2-ácidocarboxílico) (PM = 250,29)  - Sigma, código218940050, ou equivalente.Equipamentos e vidrariasAgitador de tubos de ensaioBalança analíticaBalão volumétrico de 10 mL, 50mL e 1.000 mLCronômetro digitalCubetas de vidro (4 x 1 cm)EspectrofotômetroPipeta automática (10 µL  1.000 µL)Proveta de 50 mLTubos de ensaio com tampa rosqueada (8 mL)Preparo de SoluçõesSolução de metanol a 50%Em balão volumétrico de 1 L, adicionar 500 mL deálcool metílico; completar o volume para 1.000 mLcom água destilada, homogeneizar e transferir para umfrasco de vidro, devidamente etiquetado. Armazenarem temperatura ambiente por tempo indeterminado.Solução de acetona a 70%Em balão volumétrico de 1 L, adicionar 700 mL deacetona; completar o volume para 1.000 mL com águadestilada, homogeneizar e transferir para um frasco devidro, devidamente etiquetado. Armazenar em tempe-ratura ambiente por tempo indeterminado.Solução estoque de ABTS 7 mMDissolver 192 mg de ABTS em água destilada ecompletar o volume para 50 mL em um balãovolumétrico com água destilada, homogeneizar etransferir para um frasco de vidro âmbar, devida-mente etiquetado. Armazenar sob refrigeração poraté um mês.Solução de persulfato de potássio 140 mMDissolver 378,4 mg de persulfato de potássio em águadestilada e completar o volume para 10 mL em umbalão volumétrico com água destilada, homogeneizar etransferir para um frasco de vidro âmbar, devidamenteetiquetado. Armazenar em temperatura ambiente poraté um mês.3Metodologia Cient íf ica: Determinação da At ividade Ant ioxidante Total em Frutas pela Captura do Radical Livre ABTS +Preparo do radical ABTS·+O radical ABTS·+  é preparado a partir da reação de5 mL da solução estoque de ABTS com 88 L dasolução de persulfato de potássio. Manter a mistura noescuro, à temperatura ambiente, por 16 horas. Emseguida, diluir 1 mL desta mistura em álcool etílico atéobter uma absorbância de 0,70 nm ± 0,05 nm a 734 nm.Preparar e usar apenas no dia da análise.Solução padrão de trolox 2 mMDissolver 25 mg de trolox em álcool etílico e completaro volume para 50 mL em um balão volumétrico comálcool etílico, homogeneizar e transferir para um frascode vidro âmbar, devidamente etiquetado. Preparar eusar apenas no dia da análise.Curva-Padrão do TroloxPreparo das soluçõesA partir da solução padrão de trolox (2.000 M),preparar, em balões volumétricos de 10 mL, soluçõesvariando a concentração de 100 M a 1.500 M,conforme a Tabela 1.Solução padrão Álcool Concentração de trolox (mL) etílico (mL) final ( M)0,5 9,5 1002,5 7,5 5005,0 5,0 1.0007,5 2,5 1.5001 0 0 2.000Tabela 1. Preparo das soluções para curva-padrão.Determinação da curva-padrãoEm ambiente escuro, transferir uma alíquota de 30 µLde cada solução de trolox (100 µM, 500 µM, 1.000 µM,1.500 µM e 2.000 µM) para tubos de ensaio, misturarcom 3,0 mL da solução do radical ABTS (item Prepa-ro do radical ABTS·+ ) e homogeneizar em agitador detubos. Realizar a leitura (734 nm) após 6 minutos damistura e utilizar álcool etílico como branco paracalibrar o espectrofotômetro.Plotar as concentrações de trolox ( M) no eixo X e asrespectivas absorbâncias no eixo Y (Fig. 2) e calculara equação da reta.A partir da equação da reta, calcula-se a absorbânciareferente a 1.000 M de trolox (NENADIS et al.,2004), de acordo com a Equação 1.y = -0,0003x + 0,7465R2 = 0,99400,10,20,30,40,50,60,70,80 500 1000 1500 2000Conc entraç ões de Trolox (uM)Absorbância (734 nm)Fig. 2. Exemplo de curva-padrão de trolox.Absorbância correspondente a 1.000 µM de troloxy =  ax + b                   (Eq.1)onde:x = 1.000 µM do troloxy = absorbância correspondente a 1.000 µM de troloxProtocolo do Método ABTSObtenção dos extratos da frutaEste procedimento foi adaptado de Larrauri et al.(1997). Como a concentração de compostos antioxi-dantes varia de fruta para fruta, fazem-se necessáriostestes prévios. Em análises realizadas no Laboratóriode Fisiologia e Tecnologia Pós-Colheita da EmbrapaAgroindústria Tropical, com diferentes frutas, têm-seutilizado de 1 a 25 g de amostra, de acordo com afruta. Pesar a amostra em um béquer de 100 mL,adicionar 40 mL de metanol 50%, homogeneizar edeixar em repouso por 60 minutos à temperaturaambiente. Centrifugar a 25.406,55 g (15.000 rpm)durante 15 minutos, transferir o sobrenadante para umbalão volumétrico de 100 mL. A partir do resíduo daprimeira extração, adicionar 40 mL de acetona 70%,homogeneizar e deixar em repouso por 60 minutos àtemperatura ambiente. Centrifugar novamente a25.406,55 g (15.000 rpm) durante 15 minutos,transferir o sobrenadante para o balão volumétricocontendo o primeiro sobrenadante e completar ovolume para 100 mL com água destilada.Determinação da atividade antioxidantetotal (AAT)A partir do extrato obtido no item anterior, prepararem tubos de ensaio, no mínimo, três diluições diferen-tes, em triplicata. Em ambiente escuro, transferir umaalíquota de 30 µL de cada diluição do extrato para4 Metodologia Cient íf ica: Determinação da At ividade Ant ioxidante Total em Frutas pela Captura do Radical Livre ABTS +Exemplares desta edição podem ser adquiridos na:Embrapa Agroindústria TropicalEndereço: Rua Dra. Sara Mesquita 2270, Pici,CEP 60511-110 Fortaleza, CEFone: (0xx85) 3299-1800Fax: (0xx85) 3299-1803 / 3299-1833E-mail: negocios@cnpat.embrapa.br1a edição on line: julho de 2007Comitê dePublicaçõesExpedienteComunicadoTécnico, 128Presidente: Francisco Marto Pinto VianaSecretário-Executivo: Marco Aurélio da Rocha MeloMembros: Janice Ribeiro Lima, Andréa Hansen Oster,Antonio Teixeira Cavalcanti Júnior, José JaimeVasconcelos Cavalcanti, Afrânio Arley TelesMontenegro, Ebenézer de Oliveira Silva.Supervisor editorial: Marco Aurélio da Rocha MeloRevisão de texto: José Ubiraci AlvesEditoração eletrônica: Arilo Nobre de OliveiraNormalização bibliográfica: Ana Fátima Costa Pinto.Ministério daAgricultura, Pecuáriae Abastecimentotubos de ensaio com 3,0 mL do radical ABTS·+  ehomogeneizar em agitador de tubos. Realizar a leitura(734 nm) após 6 minutos da mistura e utilizar o álcooletílico, como branco, para calibrar o espectrofotômetro.A partir das absorbâncias obtidas das diferentesdiluições dos extratos, plotar a absorbância no eixo Ye a diluição (mg/L) no eixo X. Em seguida, determinar aequação da reta. Para calcular a AAT, deve-se substi-tuir na equação da reta a absorbância equivalente a1.000 µM do padrão trolox (Eq. 1). O valor obtido parao termo x corresponde à diluição da amostra (mg/L)equivalente a 1.000 µM de trolox (Eq. 2).Cálculo das diluições do extrato (mg/L) equivalente a1.000 µM de troloxy =  ax + b                                (Eq. 2)onde:y = Absorbância correspondente a 1.000 µM detrolox (Equação 1)x = Diluição da amostra (mg/L) equivalente a 1.000µM de trolox A partir do resultado encontrado (x) na equação 2,dividir por 1.000 para ter o valor em g. O resultadofinal (Eq. 3) é calculado pela divisão de 1.000 (µM)pelo valor de X(g) e multiplicado por 1(g) para encon-trar o valor final (Z) que é expresso em µM trolox / g defruta (porção comestível).Cálculo final expresso em (µM trolox / g)AgradecimentosAo Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico eTecnológico (CNPq) e à União Européia, pelo apoiofinanceiro - Projetos Atividade antioxidante de frutasdo Nordeste brasileiro como fator de proteção dasaúde  CNPq Edital CT-Saúde/MCT/MS 030/2004 Processo 506.633/2004-7 e Producing added valuefrom under-utilised tropical fruit crops with highcommercial potential - Sixth Framework Programme Contrato 0015279, respectivamente.ReferênciasANDERSON, D. Antioxidant defences against reactiveoxygen species causing genetic and other damage.Mutation Research, v.350, n.1, p.103-108, 2000.BOREK, C. Antioxidants and cancer. Science andMedicine, p.52-62, 1997.KUSKOSKI, E.M.; ASUERO, A.G.; TRONCOSO, A.M.;MANCINI-FILHO, J.; FETT, R. Aplicatíon de diversosmétodos  químicos para  determinar actividad antioxidanteen pulpa de frutos. Ciência e Tecnologia de Alimentos,v.25, n.4, p.726-732, 2005.HALLIWELL, B. Antioxidants in human health and disease.Annual Review of Nutrition, v.16, p.33-50, 1996.LARRAURI, J.A.; RUPÉREZ, P.; SAURA-CALIXTO, F.Effect of drying temperature on the stabilitity ofpolyphenols and antioxidant activity of red grape pomacepeels. J. Agric. Food Chem. v. 45, p.1390-1393, 1997.NENADIS, N.; WANG, L.F.; TSIMIDOU, M. ZHANG, H.Y.Estimation of scavenging activity of phenolic compoundsising the ABTS·+ assay. Journal of Agricultural and FoodChemistry. v.52, p.4669-4674, 2004.RENAUD, S.C., GUEGUEN, R., SHENKER, J., D HOUTAUD,A. Alcohol and mortality in middle-aged men from easternFrance. Epidemiology, v.9, p.184-188, 1998YOUNGSON, R. Como Combater os Radicais Livres: OPrograma de Saúde dos Antioxidantes. Rio de Janeiro:Campos, 1995. 168p.X(g) = x / 1.000(Eq. 3)Z = 1.000 / X(g).1

Metodologia científica: determinação da atividade antioxidante total em frutas pela captura do radical livre ABTSº+.

http://www.infoteca.cnptia.embrapa.br/infoteca/bitstream/doc/426954/1/Cot128.pdf

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