MOURA, C. L. A. de

PINTO, G. A. S.

RODRIGUES, S.

Infoteca-e

????????????????????????????? ????????????????????????????????????????????????????????? ??????????????????????????????????????????????? ??????????????????????????????????? ?Documentos 108Embrapa Agroindústria TropicalFortaleza, CE2007ISSN 1677-1915Outubro, 2007Empresa Brasileira de Pesquisa AgropecuáriaEmbrapa Agroindústria TropicalMinistério da Agricultura, Pecuária e AbastecimentoDeterminação da Atividade deInvertase em ExtratosEnzimáticosCynthia Ladyane Alves de MouraGustavo Adolfo Saavedra PintoSueli RodriguesExemplares desta publicação podem ser adquiridos na:Embrapa Agroindústria TropicalRua Dra. Sara Mesquita 2270, PiciCEP 60511-110 Fortaleza, CECaixa Postal 3761Fone: (85) 3299-1800Fax: (85) 3299-1803Home page: www.cnpat.embrapa.brE-mail: negocios@cnpat.embrapa.brComitê de Publicações da Embrapa Agroindústria TropicalPresidente: Francisco Marto Pinto VianaSecretário-Executivo: Marco Aurélio da Rocha MeloMembros: Janice Ribeiro Lima, Andréia Hansen Oster,Antonio Teixeira Cavalcanti Júnior, José Jaime VasconcelosCavalcanti, Afrânio Arley Teles Montenegro, Ebenézer deOliveira SilvaSupervisor editorial: Marco Aurélio da Rocha MeloRevisor de texto: José Ubiraci AlvesNormalização bibliográfica: Ana Fátima Costa PintoFotos da capa: Maria Auxiliadora Coêlho de Lima, TatianaMourão Dantas, José Luiz MoscaEditoração eletrônica: Arilo Nobre de Oliveira1a edição1a impressão (2007): 200 exemplaresTodos os direitos reservadosA reprodução não-autorizada desta publicação, no todo ou emparte, constitui violação dos direitos autorais (Lei no 9.610).Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)Embrapa Agroindústria TropicalMoura, Cynthia Ladyane Alves de.Determinação da atividade de invertase em extratosenzimáticos / Cynthia Ladyane Alves de Moura, Gustavo AdolfoSaavedra Pinto, Sueli Rodrigues. – Fortaleza : EmbrapaAgroindústria Tropical, 2007.18 p. (Embrapa Agroindústria Tropical. Documentos, 108).ISSN 1677-19151. Invertase. I. Pinto, Gustavo Adolfo Saavedra. II. Rodrigues,Sueli. III. Título. IV. Série.CDD 634.41© Embrapa 2007Cynthia Ladyane Alves de MouraEngenheira de Alimentos, B. Sc., Bolsista de ApoioTécnico da Embrapa Agroindústria TropicalGustavo Adolfo Saavedra PintoQuímico Tecnológico, D. Sc. em Tecnologia deProcessos Químicos e Bioquímicos, Pesquisador daEmbrapa Agroindústria Tropical, Fortaleza, CE,gustavo@cnpat.embrapa.brSueli RodriguesEngenheira Química, D. Sc. em Engenharia Química,Professora do Departamento de Tecnologia deAlimentos da Universidade Federal do Ceará - UFCAutoresApresentaçãoAs enzimas são biomoléculas responsáveis pela catálise de diferen-tes reações em sistemas biológicos. Através da diminuição da energia deativação reacional, elas possibilitam que a vida possa ocorrer em condiçõesamenas de temperatura e pressão. Industrialmente, esse fato vem desper-tando muito interesse, pois permite a economia de energia a ser aportadaaos processos de conversão, gera menos co-produtos e resíduos, sendoparte de um sistema ambientalmente amigável.Contudo, uma das grandes dificuldades do trabalho com enzimas écomo mensurá-las. Ao contrário de compostos químicos, para os quais osmétodos analíticos fornecem uma concentração (como por exemplo: g.L-1,Molar, etc.), as enzimas são mensuradas quanto a sua velocidade deconversão. Dessa forma, diferentes métodos ou, simplesmente, diferentesformas de se ver um mesmo método, podem levar a resultados, valores deatividade distintos, sem que efetivamente um esteja mais correto que ooutro. Isso, muitas vezes, impossibilita a comparação entre valoresabsolutos de um trabalho com outro.Os artigos científicos, na imensa maioria dos casos, não explicitacomo a análise é feita, ou como se calcula a atividade, apenas cita comoela é expressa. Assim, este trabalho teve como apresentar aos leitores osdetalhes da análise de invertase, seus pontos problemáticos e a forma decálculo da atividade desta enzima, a fim de possibilitar a fácil reproduçãodo método por qualquer pessoa interessada.Lucas Antônio de sousa LeiteChefe-GeralEmbrapa Agroindústria TropicalSumárioIntrodução ............................................................. 9Materiais Necessários .............................................. 10Preparo de Soluções ................................................ 11Curva-Padrão de Glicose .......................................... 13Seqüência de Análise da Atividade ............................ 15Referências............................................................. 17Determinação da Atividadede Invertase em ExtratosEnzimáticosCynthia Ladyane alves de MouraGustavo  Adolfo Saavedra PintoSueli RodriguesIntroduçãoA invertase (E.C. 3.2.1.26), ou β-D-fructo-furanosidio-frutohidrolase, ousacarase, é a enzima responsável pela liberação do resíduo L-D-fructofuranosidio não-redutor, a partir da molécula de dissacarídeo (Gracida-Rodríguez et al., 2005). Seu substrato preferencial é a sacarose, resultandona sua hidrólise uma molécula de glicose e outra de frutose, porém,também, pode hidrolisar ramonose e estaquiose (Fiedurek et al., 2000).Historicamente, esta enzima tem grande importância, uma vez que foi aprimeira proteína a ser identificada como um biocatalisador. Também, foi apartir de estudos com invertase, que foram construídos os princípiosfundamentais da enzimologia, como a hipótese de chave-fechadura paraatividade enzimática (Brown, 1902), a equação de Michaelis-Menten(Michaelis & Menten, 1913), o conceito de ponto isoelétrico (Michaelis &Davidsohn, 1911; Michaelis & Rothstein, 1920) e a hipótese de Briggs &Haldane (1925), em que o complexo formado entre enzima e substrato nãorepresenta um equilíbrio, mas sim um estado estacionário.A invertase está presente em diversas frutas e tubérculos, como porexemplo: mamão, manga, banana, peras, maçãs, batatas entre outras,tendo grande participação nos seus processos de amadurecimento eapodrecimento (Chapper et al., 2004; Torija et al., 1998).10 Determinação da Atividade de Invertase em Extratos EnzimáticosIndustrialmente, as invertases têm seu maior campo de aplicação na áreade alimentos, especialmente na preparação de geléias, balas, doces exapores (Gracida-Rodríguez et al., 2005). No processo de fabricação dexaropes, sua utilização tem vantagens significativas, uma vez que nãoapresenta a formação de subprodutos (Swain & Stephan, 2005). Pesquisasrecentes apontam potenciais usos na produção de ácido lático, a partir dafermentação de melaço de cana (Acosta et al., 2000); na produção deetanol, onde evitariam a formação de sorbitol durante o processo debioconversão (Lee & Huang, 2000; Kirk & Doelle, 1993). Na sua formaimobilizada, essa enzima também apresenta potencial na fabricação dexaropes, o que permitiria sua utilização em várias bateladas ou de formacontínua (Almeida et al., 2005) e, também, na preparação de biosensores,que permitiriam a quantificação em tempo real, e dentro de bioreatores deconcentração de sacarose em meios fermentativos (Park et al., 1991).O objetivo deste trabalho é fornecer ao leitor uma descrição de todas asetapas necessárias para a determinação de atividade de invertase presenteem extrato enzimático, de forma clara, fazendo observações sobre pontosde dúvida que possam induzir a erros.Materiais NecessáriosReagentes• Sacarose P.A.• Glicose P.A.• Ácido acético glacial• Acetato de sódio P.A.• Ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS)• Hidróxido de sódio (NaOH)• Tartarato duplo de sódio e potássio tetrahidratado (KNaC4H4O6 . 4 H2O)11Determinação da Atividade de Invertase em Extratos EnzimáticosEquipamentos e Materiais• Balança analítica• Banho termostático com circulação de água• Agitador de tudos de ensaio• Pipetas graduadas (1 mL, 10 mL e 20 mL)• Tubos de ensaio médios• Balão volumétrico de 100 mL, 250 mL e 1000mL• Bechers diversos• Frascos ambar• Cronômetro digital• Espectrofotômetro Vis• Cubetas de vidroPreparo de SoluçõesSolução de ácido acético 200 mM (1000 mL)Transferir 11,6 mL de ácido acético glacial para balão de 1000 mL, jácontendo 100 mL de água destilada. Homogeneizar, completar o volume ehomogenizar novamente. Transferir para um frasco de vidro devidamenteetiquetado.Armazenar em geladeira por tempo indeterminado.Solução de acetato de sódio 200 mM (1000 mL)Dissolver 16,4 g de acetado de sódio (C2H3O2Na) ou 27,2 g de acetado desódio triidratado (C2H3O2Na . 3 H2O) em 500 ml de água destilada, transfe-rir para um balão de 1000 mL e completar com água destilada,homogeneizar e transferir para um frasco de vidro devidamente etiquetado.Armazenar em geladeira por tempo indeterminado.12 Determinação da Atividade de Invertase em Extratos EnzimáticosTampão acetato 100 mM, pH 5,0 (1000 mL)Misturar 148 mL da solução de ácido acético 200 mM com 352 mL dasolução de acetato de sódio 200 mM, completar o volume para 1000 mLcom água destilada e homogeneizar.Verificar o pH do tampão.Armazenar em geladeira por tempo indeterminado.Solução padrão de glicose 1000 mg/L (1000 mL)Pesar em balança analítica 1000 mg de glicose, em seguida dissolver emaproximadamente 200 mL de água destilada sob agitação constante,transferir analiticamente para um balão volumétrico 1000 mL, aferir ovolume e homogeneizar vigorosamente.Essa solução não pode ser armazenada!Solução de sacarose 100 mM em tampão acetato 100 mMpH 5,0 (100 mL)Pesar em balança analítica 3,420 g de sacarose, em seguida dissolver em50 mL de tampão acetato 100 mM pH 5,0, transferir analiticamente paraum balão volumétrico de 100 mL, aferir o volume com solução tampão ehomogeneizar vigorosamente.Transferir o conteúdo para frasco de vidro etiquetado e armazenar nageladeira por, no máximo, sete dias.Reagente de DNS (250 mL)Pesar 4,0 g de hidróxido de sódio e dissolver em 50 mL de água destilada.Pesar 2,5 g de DNS e adicionar à solução de NaOH recém preparada.Pesar 75,0 g de tartarato duplo de sódio e potássio e dissolver, sobagitação constante, em 125 mL de água destilada.Adicionar à solução de DNS a solução de tartarato, sob aquecimento, atédissolver completamente.13Determinação da Atividade de Invertase em Extratos EnzimáticosDeixar esfriar, transferir para balão volumétrico de 250 mL, completar ovolume com água destilada e homogeneizar.Esta solução deve ser armazenada à temperatura ambiente por tempoindeterminado.Curva-Padrão de GlicoseObservação 1: diferentes grupos, laboratórios ou pessoas costumampreparar esta curva-padrão de modo distinto. Enquanto uns utilizam umasolução de glicose, outros utilizam uma mistura de glicose e frutose emquantidades iguais, ainda existem outros que usam uma solução desacarose invertida com ácido clorídrico. Todos os três modos de prepara-ção da curva-padrão foram testados no laboratório da EmbrapaAgroindústria Tropical e produziram resultados coincidentes. Desse modo,optou-se pela simplicidade operacional: a curva-padrão baseada na soluçãode glicose.Obtenção dos dados para curva-padrãoA partir da solução padrão de glicose, preparar em balões volumétricos de100 mL, soluções com concentração variando de 100 mg/L a 900 mg/L deglicose, conforme a Tabela 1.Transferir para tubos de ensaios 1,0 mL de cada solução preparada,incluindo a solução padrão. Adicionar 1,0 mL de solução de DNS ehomogeneizar vigorosamente.Levar os tubos para banho-maria com água em ebulição. Após 5 minutos,retirar os tubos do aquecimento e coloca-los em recipiente com água àtemperatura ambiente.Adicionar 8,0 mL de água destilada, homogeneizar vigorosamente e ler emespectrofotômetro a 540 nm.O espectrofotômetro deve ser calibrado com amostra sem glicose, ouseja, 1,0 mL de solução corresponde a 1,0 mL de água destilada.14 Determinação da Atividade de Invertase em Extratos EnzimáticosTabela 1: Exemplo de preparo das soluções diluídas de glicose a partir dasolução padrão de 1000 mg/L.Solução de ácido gálico Água destilada Concentração final(mL) (mL) (mgL)10 90 10020 80 20030 70 30040 60 40050 50 50060 40 60070 30 70080 20 80090 10 900Construção da curva-padrãoPlotar, em planilha ou calculadora científica, a aborbância no eixo Y contraa concentração de glicose (mg/L) no eixo X (Figura 1). A partir do coefici-ente angular da reta ajustada, calcula-se o fator de concentração (Eq. 1).y = 0,000872xR2 = 0,998103Fator = 1146,790,00,10,20,30,40,50,60,70,80,91,00 200 400 600 800 1000 1200Glicose (mg.L-1)AbsorbânciaFig. 1. Modelo de gráfico de curva padrão de glicose.15Determinação da Atividade de Invertase em Extratos EnzimáticosangularCoefFator.1= (Eq. 1)Seqüência de Análise da  AtividadeEtapa I: Incubação das amostrasEm tubo de ensaio contendo 500 mL de solução de sacarose 0,1 M,adicione 400 mL de tampão acetato 100 mM, pH 5,0, homogeneizevigorosamente e leve para banho termostático a 30 oC por 10 minutos,para aclimatação.Adicione 100 mL da amostra enzimática, homogeneize e incube a30 oC por 30 minutos. Para paralisar a reação, adicionar 1 mL do reagentede DNS e homogeneizar vigorosamente.Observação 2: Caso seja necessário a amostra enzimática pode serdiluída. Para tanto, recomenda-se utilizar como diluente o tampão acetato100 mM, pH 5,0, ao invés de água destilada.Observação 3: O tempo de 30 minutos deverá ser medido com auxílio deum cronômetro digital, preferencialmente.Observação 4: Normalmente, são realizadas análises de vários extratosenzimáticos simultaneamente. Deve-se, portanto, tomar precauções paraque o intervalo de adição entre duas amostras, permita ao operadorrealizar todas as operações necessárias, como troca de pipeta ou ponteira,enchimento e esvaziamento da pipeta, agitação dos tubos, etc. Sugerem-se intervalos de 30 segundos ou 60 segundos, dependendo do treino doanalista. Os intervalos devem ser uniformes.Observação 5: O tempo de incubação de 30 minutos deve ser obedecidopara cada tubo de ensaio em que esteja sendo adicionado extratoenzimático, e não apenas para o primeiro tubo da seqüência de análise.16 Determinação da Atividade de Invertase em Extratos EnzimáticosEtapa II: Branco das amostrasObservação 6: As amostras enzimáticas podem, ou não, ter gruposredutores presentes, oriundos do meio de fermentação, por exemplo. Parase evitar uma super-estimativa da atividade da enzima, deve-se fazer, paracada amostra, um branco correspondente, visando descontar contribuiçãodestes grupos redutores.Em tubo de ensaio contendo 500 mL de solução de sacarose 0,1 M,adicione 400 mL de tampão acetato 100 mM, pH 5,0, homogeneizevigorosamente. Adicione 1 mL do reagente de DNS e torne ahomogeneizar. Em seguida, adicione 100 mL da amostra enzimática.Etapa III: Determinação dos grupos redutoresLevar os tubos com DNS para banho-maria com água em ebulição. Após 5minutos, retirar os tubos do aquecimento e coloca-los em recipiente comágua à temperatura ambiente.Adicionar 8,0 mL de água destilada, homogeneizar vigorosamente e ler emespectrofotômetro a 540 nm.Observação 7: O espectrofotômetro deve ser calibrado com amostra sema presença de grupos redutores, ou seja, a 1,0 mL de DNS, adiciona-se1,0mL de água destilada.Etapa IV: Cálculo da atividade de invertaseUma unidade (U) de atividade de invertase foi definida como a quantidadede enzima capaz de liberar 1mmol de grupos redutores, medidos comoglicose, por minuto, nas condições de reação utilizadas.( )540)( DiluiçãoxFatorxAbsAbsUInvertase brancoamostra −= (Eq. 1)Absamostra. →  Absorbância da amostraAbsbranco. →  Absorbância do branco correspondenteFator →  Fator de concentração da curva-padrão de glicose (mg/L)Diluição →  Diluição do extrato enzimático540 →  Fator de conversão para atividade (u.m.a.-1 x min-1)17Determinação da Atividade de Invertase em Extratos EnzimáticosACOSTA, N.; BELDARRAÍN, A.; RODRÍGUEZ, L.; ALONSO, Y. Characterization ofrecombinant invertase expressed in methylotrophic yeasts. Biotechnology and AppliedBiochemistry, v. 32, p. 179-187, 2000.ALMEIDA, A. C. S.; ARAÚJO, L. C.; COSTA, A. M.; ABREU, C. A. M.; LIMA, M. A.G. A; PALHA, M. A. P. F. Sucrose hydrolysis catalyzed by auto immobilizedinvertase into intact cells of Cladosporium cladosporioides. Eletronic Journal ofBiotechnology, v. 8, n. 1, 2005.BRIGGS, G. E.; HALDANE, J. B. S. A note on the kinetics of enzyme action.Biochemical Journal, v. 19, p. 338-339,1925.BROWN, A.J. Enzyme action. Journal of Chemical Society, v. 81, p. 373-386, 1902.CHAPPER, M.; BACARIN, M. A.; PEREIRA, A. S.; LOPES, N. F. Atividade amidolíticae de invertase ácida solúvel em tubérculos de batata armazenados sob duas condi-ções de temperatura. Horticultura Brasileira, v. 22, n. 3, p.597-601, 2004.FIEDUREK, J.; PIELECKI, J.; SKOWRONEK, M. 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Determinação da atividade de invertase em extratos enzimáticos.

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