ANDRIOLI, A.

PINHEIRO, R. R.

SOUSA, F. M. L.

SOUZA, K. C. de

Infoteca-e

Protocolos para Extração doDNA-proviral e PCR doLentivírus Caprinoem SangueAlice Andrioli1Kelma Costa de Souza2Raymundo Rizaldo Pinheiro3Fabiane Maria Lima Sousa21Med. Vet., D. Sc., Embrapa Caprinos. Estrada Sobral/Groaíras, Km 04, Caixa Postal 145,CEP 62010-970 - Sobral/CE. Email: alice@cnpc.embrapa.br2Bolsista, Zootecnia, Universidade Estadual Vale do Acaraú.3Med. Vet., D. Sc, Embrapa Caprinos. E-mail: rizaldo@cnpc.embrapa.br72ISSN 1676-7675Sobral, CEDezembro, 2006ComunicadoTécnicoOn lineA Artrite Encefalite Caprina (AEC), causada pelo lentivíruscaprino (LVC), é uma enfermidade crônica, incurável emultisistêmica (Cork et al. 1974). A ocorrência da AEC emum rebanho caprino leva a perdas econômicas considerá-veis, inclusive a queda na produção de leite.Para o controle efetivo dessa enfermidade, é importanteque os métodos de diagnóstico identifiquem todos osanimais portadores, visto que a AEC é, muitas vezes,assintomática e pode ser transmitida pelo contato diretoentre os animais, além de apresentar várias outras vias detransmissão (ingestão de leite/colostro; secreções; instru-mentos perfurantes contendo sangue de animais contami-nados, dentre outras).Dessa forma, a manutenção de animais falso-negativos norebanho representa sérios problemas sanitários, dificultan-do o controle da doença.Os testes diagnósticos podem ser divididos em dois tipos:os que detectam os anticorpos, por exemplo, o teste deimunodifusão em gel de ágar (IDGA) e o enzyme linkedimmunoassay (ELISA) e, os que detectam diretamente oagente, que são isolamento viral, a hibridização in situ e areação de cadeia da polimerase (PCR).Devido à confiabilidade e à facilidade na coleta das amos-tras, os testes para detecção de anticorpos anti-AEC, comoo IDGA e o ELISA, permanecem sendo os mais utilizados.Como a infecção dos monócitos e macrófagos peloslentivírus é persistente e há a recorrente expressão dosgenes virais estimulando o sistema imune (Cheevers et al.1988) há, normalmente, anticorpos circulantes no sorodos animais infectados.No entanto, o nível de anticorpos circulantes varia entreanimais e no mesmo animal, dependendo do seu estadofisiológico. No teste de IDGA, a reação positiva só ocorrenum nível determinado de anticorpos, de forma que, se onível de anticorpos estiver abaixo do detectável, o animalserá falso-negativo ao teste.Dentre as técnicas utilizadas para o diagnóstico direto depatógenos, destaca-se a PCR, cujo objetivo é a amplifica-ção in vitro dos ácidos nucleicos, permitindo a obtençãoid23523500 pdfMachine by Broadgun Software  - a great PDF writer!  - a great PDF creator! - http://www.pdfmachine.com  http://www.broadgun.com 2 Protocolos para extração do DNA-proviral e PCR ...de milhares de cópias de uma seqüência específica deDNA.A PCR vem sendo adotada em todo o mundo na pesquisa demicroorganismos devido à sua especificidade, sensibilidade erapidez de resultados (Belák & Ballagi-Pordány, 1993).Os primeiros trabalhos sobre o uso da PCR apareceram nofinal dos anos 80, e têm sido de grande importância para odiagnóstico de doenças virais, em várias amostras detecidos e secreções de animais. A vantagem da PCR é queesta técnica pode detectar pequenas quantidades de DNAviral presentes no material, amplificando-o em quantidadesidentificáveis.Até mesmo patógenos de difícil crescimento em cultivo invitro ou que se encontrem sob estado de latência ouintegrados ao genoma do hospedeiro, ou microorganismosmortos, podem ser detectados por essa técnica.Dentre as várias doenças virais de importância veterináriajá detectadas por PCR, estão as lentiviroses de pequenosruminantes (LVPR) (Zanoni et al., 1990).A PCR tem sido utilizada para a pesquisa do DNA proviraldo lentivírus de caprinos em diferentes amostras, como:sangue, líquido sinovial, leite e soro do leite, tecidos esêmen (Reddy et al., 1993; Rimstad et al., 1994;Barlough et al., 1994; Clavijo & Thorsen, 1996; Andrioliet al., 2006).No caso dos LVPR, essa técnica é particularmente impor-tante para a identificação de animais que apresentamsoroconversão tardia ou com resultado sorológico duvido-so (Rimstad et al., 1993). Porém, parece não haver relaçãoentre o nível de anticorpos e o resultado positivo à PCR(Barlough et al., 1994) e nem todas as amostras desangue positivas aos testes sorológicos são tambémpositivas na PCR (Reddy et al., 1993).Zanoni et al. (1990) demonstraram que a detecção do DNAproviral do LVPR em cultivo celular pode ser obtida um diaapós inoculação e que o PCR apresentou alta sensibilidade,sendo capaz de identificar o vírus em uma célula infectadadentro de uma cultura contendo 106 células.Barlough et al. (1994), observaram que uma amostra comtrês mil monócitos contendo de 30 a 240 célulasinfectadas foi suficiente para gerar resultados positivos naPCR. Os autores avaliaram a quantidade de monócitos deamostras de sangue de cinco caprinos positivos para aAEC, diluíram essas amostras e realizaram PCR de cadauma delas para determinar, por cálculos, o número demonócitos necessários para obter reação positiva na PCR.Os dados revelaram uma quantitativa diferença no nível decélulas associadas ao vírus entre os cinco animais testados,os quais variaram de 103 a 105 monócitos para a detecção.Dessa forma, parece que a taxa de infecção dos monócitosvaria entre indivíduos portadores da AEC, provavelmentedevido ao nível de restrição da expressão viral (Narayan etal., 1983).O objetivo deste trabalho foi padronizar um método eficaz deextração do DNA-proviral do LVC em amostras de sangue.Foi coletado sangue em tubos vacuntainer de 5ml comEDTA, de três machos caprinos da raça Anglo-nubiana,com infecção comprovada sorologicamente porImunodifusão em Gel de Ágar (IDGA).Em seguida, as amostras de sangue foram processadas,segundo três protocolos de extração:Protocolo A, segundo Walsh et al. (1991):- Colocar 5µl de sangue em tubos de eppendorfcontendo 1ml de água destilada MilliQ autoclavada;- Homogeneizar e centrifugar (1500g) por trêsminutos;- Retirar o sobrenadante e acrescentar ao pellet 200µlde Chelex à 5%;- Incubar as amostras à 56°C em banho-maria por30 minutos e em vortex por 10 segundos;- Incubar à 95°C, por oito minutos, e em vortex por10 segundos;- Centrifugar à 1000-1500g por três minutos;- Armazenar as amostras entre 2 e 8°C.Protocolo B, segundo Caldas et al. (2000):- Centrifugar 5ml de sangue por seis minutos a4000g;- Retirar a camada de leucócitos (100µl) e colocar emeppendorf, juntamente com 500µl de solução de trisEDTA;- Centrifugar por mais seis minutos à 4000g, retirar osobrenadante e repetir a operação;- Após a segunda centrifugação, o sobrenadantedeve ser retirado. Ressuspender o pellet em 500µl de3Protocolos para extração do DNA-proviral e PCR ...Tampão K (10mM de Tris HCl pH 8,0; 50mM de KCl;2mM de MgCl2; 0,5% de Tween 20; 100µg/mL deproteinase K = 0,1µg/µL);- Incubar as amostras em banho-maria por 45minutos, a 56°C;- Incubar a 95°C por 10 minutos;- Armazenar as amostras entre 2ºC e 8°C.Protocolo C, segundo Panteleeff et al. (1999):- Centrifugar 5ml de sangue por seis minutos a4000g;- Retirar a capa de leucócitos (100µl) e acrescentar1ml de PBS;- Centrifugar a 1100g por cinco minutos;- Retirar o sobrenadante e acrescentar mais 1ml desolução tampão salina, repetindo a operação;- Retirar o sobrenadante e acrescentar ao pellet 1mlde tampão de lise (10mM Tris-HCl, pH 8,3; 50mM KCl;100µg de gelatina; 0,45% de tween 20; 0,45% nonidetP-40; 60µg de proteinase K por mL);- Incubar a 56°C por 90 minutos;- Incubar as amostras por 20 minutos a 95°C;- Centrifugar a 1100g por sete minutos;- As amostras devem ser armazenadas a 20°Cnegativos.Na amplificação do DNA, foram utilizados dois pares deoligonucleotídeos iniciadores, determinados a partir daregião gag da amostra padrão CAEV-Cork (Saltarelli et al.,1990), sendo os iniciadores P1 = 5'CAAGCAGCAGGAGGGAGAAGCTG3' (posição genômica 953-975) e P2 = 5'TCCTACCCCC ATAATTTGATCCAC3'(posição genômica 12491226), descritos por Barloughet al., (1994), que amplificaram um fragmento alvo de297 pb. Em seguida, foram utilizados os oligonucleotídeosiniciadores internos P3 =5GTTCCAGCAACTGCAAACAGTAGCAATG-3' (posiçãogenômica 9971024) e P4 = 5' ACCTTTCTGCTTCTTCATTTAATTTCCC 3' (posição genômica11811154) para a segunda amplificação (Nested PCR),para a obtenção de um fragmento alvo final de 185 pb(Rimstad et al., 1993).A reação de PCR Nested (PCRn) foi realizada segundometodologia de Barlough et al. (1994), com algumasmodificações. A reação consistiu de um volume total de50µL, contendo: tampão Tris HCl (pH 8,3) 10mM; KCl50mM; MgCl2 1,5mM; Gelatina 0,001% (p/v); dNTP,100 µM de cada; TMAC 5µM ; 20pmoL de cadaoligonucleotídeo iniciador (ciclo 1  iniciadores P1 e P2;ciclo 2  iniciadores P3 e P4); Taq DNA polimerase (2 UI);DNA da amostra: 3µL no ciclo 1 e 1 µL de produto dociclo 1 no ciclo 2, sendo o volume final completado comágua destilada MilliQ autoclavada.As reações de amplificação foram realizadas emtermociclador (Programmable Thermal Controller, PTC-100, MJ Research, Inc.), com os seguintes termais: umciclo inicial para desnaturação a 94°C por 5 minutos;seguido de 35 ciclos de 94°C por 1 minuto; 56°C por 1minuto, 72°C por 45 segundos; seguidos de extensãofinal a 72°C por 7 minutos e término a 4°C.As amostras amplificadas e os controles positivo enegativo, juntamente com o marcador molecular, foramsubmetidos à eletroforese em gel de agarose 1% em TBE(tris, borato e EDTA 0,1X), corado com brometo de etídio(0,5µg). Cada amostra (15µL) juntamente com 3µL detampão da amostra, foi submetida à eletroforese em cubahorizontal, com TBE (0,5X), por 60 minutos (2amp e 90volts). A visualização dos fragmentos amplificados deDNA foi feita em transiluminador de luz ultravioleta.ResultadosO protocolo B amplificou o DNA-proviral no sangue dedois animais, enquanto que os protocolos A e C, amplifica-ram em apenas um. É importante notar que esses doisprotocolos detectaram o DNA-proviral em animais diferen-tes (Tabela 1).Animal Protocolo A Protocolo B Protocolo C1 + + -2 - + +3 - - -Tabela 1. Comparação dos protocolos de extração doDNA-proviral do LVC em sangue.O animal 3, embora portador do vírus, não apresentouresultado positivo em nenhum dos protocolos testados,indicando que as técnicas testadas ou não são capazes dedetectar 100% das amostras, ou o DNA viral não estavapresente no seu sangue. De Andrés et al., (2005) tambémobservaram que a PCR não é capaz de detectar todos osanimais portadores do LVC.4 Protocolos para extração do DNA-proviral e PCR ...185 pbFig. 1. Gel de agarose 1% corado com brometo de etídio. PCR de amostrasde sangue, bandas de 185pb, sendo: M marcador DNA Ladder; 4, 5, 6 e7  amostras positivas; 1,2,3 e 8 - amostras negativas; 9 - controlepositivo e 10 - controle negativo.A realização de apenas um teste de IDGA também não ésuficiente na detecção do lentivírus caprino. Além disso,foi observado que em amostras de sangue (PCRn) e soro(IDGA) coletadas conjuntamente, ocorriam resultadosdiscordantes nos testes (Andrioli, 2006).Embora a PCR identifique animais portadores do LVC antesda soroconversão, tem-se relatado que após asoroconversão a PCR é menos sensível quando comparadaaos testes sorológicos, de forma que há recomendação quese utilize a associação dos dois testes num programa decontrole (De Andrés et al., 2005).A dificuldade em amplificar o DNA-proviral dos lentivíruspode estar na sua característica de alta taxa de mutação(Suarez & Whetstone, 1997). A variação das seqüências debases no genoma dos lentivírus afeta a eficiência da PCR,pois esta é intimamente dependente da complementaridadeentre os primers/ templates (Pasick, 1998). Os LVPRapresentam grande variação antigênica (Ellis et al., 1988) eexistem também variações fenotípicas que refletem opotencial patogênico do vírus (Pasick, 1998).Em continuidade ao experimento, elegeu-se o protocolo deextração B para ser utilizado em sete reprodutores portado-res do vírus da AEC, sendo que todas as amostrasapresentaram resultados positivos.Devido à ocorrência de falsos negativos nos testes deIDGA e PCR, indica-se a associação dos dois testes para ocontrole da AEC.Para padronizar o protocolo de extração do DNA-proviraldo LVC em sangue, é necessário determinar a sensibilidadee a especificidade do teste, além da repetibilidade dosresultados, sendo que essas ações estão sendo realizadasno laboratório de biologia molecular da Embrapa Caprinos.Agradecimento ao Banco do Nordeste  BNB e à Funda-ção Cearense de Amparo a Pesquisa  Funcap, pelo apoiofinanceiro.Referências bibliográficasANDRIOLI, A.; GOUVEIA, A. M. G.; MARTINS, A. S.;PINHEIRO, R. R.; SANTOS, D. O. 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Infection and Immunity, v.5Protocolos para extração do DNA-proviral e PCR ...Exemplares desta edição podem ser adquiridos na:Embrapa CaprinosEndereço: Estrada Sobral/Groaíras, Km 04 - CaixaPostal 145, CEP 62010-970  Sobral, CEFone: (0xx88) 3677-7000Fax: (0xx88) 3677-7055Home-page: www.cnpc.embrapa.brE-mail: www.cnpc.embrapa.br/sac.htm1a edição On line (dez./2006)Presidente: Diônes Oliveira dos SantosSecretária-Executiva: Luciana Cristine Vasques VillelaMembros: Alexandre César Silva Marinho  Verônica Vasconcelos Freire  Marcelo Renato Alves Araújo  Tânia Maria Chaves CampêloSupervisor editorial: Alexandre César Silva MarinhoRevisão de texto: José Carlos Mendes VasconcelosNormalização bibliográfica: Alexandre C. S.  MarinhoEditoração eletrônica: Alexandre César Silva MarinhoComitê depublicaçõesExpedienteComunicadoTécnico, 72On LineGOV ERNO FEDERA L41, p. 67-73, 1983.PANTELEEFF, D. D.; JOHN, G.; NDUSTI, R.; MBORI-NGACHA, D.; RICHARDSON, B.; KREISS, J.;OVERBAUGH, J. 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Protocolos para extração do DNA-proviral e PCR do lentivírus caprino em sangue.

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