ALVES, R. E.

BRITO, E. S. de

MORAIS, S. M. de

PÉREZ-JIMÉNEZ, J.

RUFINO, M. do S. M.

SAMPAIO, C. de G.

SAURA-CALIXTO, F. D.

Infoteca-e

125ISSN 1679-6535Dezembro, 2006Fortaleza, CEon lineMaria do Socorro Moura Rufino1Ricardo Elesbão Alves2Edy Sousa de Brito3Selene Maia de Morais4Caroline de Goes Sampaio5Jara Pérez-Jiménez6Fulgencio Diego Saura-Calixto7Foto: Maria do Socorro M. Rufino1 Engenheira Agrônoma, M. Sc., Bolsista da CAPES, Doutoranda, UFERSA, BR 110, Km 47, 59625-900, Mossoró, RN, marisrufino@yahoo.com.br2 Engenheiro Agrônomo, D. Sc. em Pós-Colheita, Pesquisador da  Embrapa Agroindústria Tropical, R. Dra. Sara Mesquita, 2270, Pici, 60511-110, Fortaleza, CE,elesbao@pesquisador.cnpq.br3Químico Industrial,  D. Sc. em Tecnologia de Alimentos, Pesquisador da Embrapa Agroindústria Tropical, edy@cnpat.embrapa.br4Química Industrial, Ph.  D., Professora Titular, UECE, Av. Paranjana, 1700, Campus do Itaperi, 60740-000, Fortaleza, CE, selene@uece.br5Graduanda em Química, Bolsista CNPq, UECE6 Licenciada em Ciência e Tecnologia dos Alimentos, Doutoranda/I3P-CSIC, Departamento de Metabolismo y Nutrición, Instituto del Frío, CSIC, Ciudad Universitaria,José Antonio Novais, 10, 28040, Madri, Espanha7 Licenciado em Ciências Químicas, Professor, Pesquisador, D.Sc., CSIC, fsaura@if.csic.esMetodologia Científica:Determinação da AtividadeAntioxidante Total em Frutaspelo Método de Redução doFerro (FRAP)IntroduçãoAntioxidantes podem ser definidos como qualquersubstância que, presente em baixas concentrações,quando comparada a um substrato oxidável, atrasa ouinibe a oxidação desse substrato de maneira eficaz. Osistema de defesa antioxidante é formado por compos-tos enzimáticos e não-enzimáticos, presentes tanto noorganismo (localizados dentro das células ou nacirculação sangüínea) como nos alimentos ingeridos(Moreira & Shami, 2004).O consumo de substâncias antioxidantes na dietadiária pode produzir uma ação protetora efetiva contraesses processos oxidativos que ocorrem no organismo.Foi descoberto que várias doenças, entre as quaiscâncer, aterosclerose, diabetes, artrite, malária, AIDSe doenças do coração, podem estar ligadas aos danoscausados por formas de oxigênio extremamentereativas. Essas substâncias, também, estão ligadas aprocessos responsáveis pelo envelhecimento do corpo(Degaspari & Waszczynskyj, 2004).Pulido et al. (2000) descrevem o método FRAP (FerricReducing Antioxidant Power) – Poder Antioxidante deRedução do Ferro (Fig. 1) como uma alternativadesenvolvida para determinar a redução do ferro emfluidos biológicos e soluções aquosas de compostospuros. O método pode ser aplicado não somente paraestudos da atividade antioxidante em extratos dealimentos e bebidas, mas, também, para o estudo daeficiência antioxidante de substâncias puras, comresultados comparáveis àqueles obtidos com outrasmetodologias mais complexas.Thaipong et al. (2006) estimaram a atividade antioxi-dante total de extratos obtidos de frutos de goiaba, pelosmétodos ABTS, DPPH, FRAP e ORAC, e verificaram2 Metodologia Científica: Determinação da Atividade Antioxidante Total em Frutas pelo Método de Redução do Ferro (FRAP)[Fe(III)(TPTZ)2]3+                                                     [Fe(II)(TPTZ)2]3+cor: azul-clara                                                          cor: azul-escuraFig. 1. Redução do complexo TPTZ (2,4,6-tri(2-piridil)-1,3,5-triazina) com Fe3+.Ilustração: Edy Sousa de Britoque FRAP foi a técnica mais reprodutível e aquela queapresentou uma elevada correlação com os teores deácido ascórbico e grupos fenólicos.Neste comunicado são relatadas todas as informaçõesnecessárias para a determinação da atividade antioxi-dante total em frutas, pelo método de redução do ferro(FRAP), baseadas em adaptações/modificações feitasnos laboratórios da Embrapa Agroindústria Tropical.Materiais NecessáriosReagentes• Acetato de sódio trihidratado (PM = 136,08)• Acetona P.A.• Ácido acético glacial P.A.• Ácido clorídrico P.A. (PM = 36,5; d = 1,19)• Água destilada• Álcool metílico P.A.• Cloreto férrico hexahidratado (PM = 270,3)• Sulfato ferroso heptahidratado (PM = 278,02)• TPTZ (2,4,6-Tris(2-piridil)-s-triazina) (PM = 312,34)- Sigma, código T1253 ou equivalente.Equipamentos e Vidrarias• Agitador de tubos de ensaio• Balança analítica• Balão volumétrico de 10 mL, 50 mL e 1.000 mL• Banho-maria• Cronômetro digital• Cubetas de vidro (4 x 1 cm)• Espectrofotômetro• Pipeta automática (10 µL – 1.000 µL)• Proveta de 50 mL• Tubos de ensaio com tampa rosqueada (8 mL)Preparo de SoluçõesSolução de Metanol a 50%Em balão volumétrico de 1 L, adicionar 500 mL deálcool metílico; completar o volume para 1.000 mLcom água destilada, homogeneizar e transferir paraum frasco de vidro devidamente etiquetado. Armazenarem temperatura ambiente por tempo indeterminado.Solução de Acetona a 70%Em balão volumétrico de 1 L, adicionar 700 mL deacetona; completar o volume para 1.000 mL com águadestilada, homogeneizar e transferir para um frasco devidro devidamente etiquetado. Armazenar em tempe-ratura ambiente por tempo indeterminado.Solução de HCl 40 mMEm balão volumétrico de 1 L, adicionar 3,34 mL de HClconcentrado; completar o volume para 1.000 mL comágua destilada, homogeneizar e transferir para umfrasco de vidro devidamente etiquetado. Armazenarem temperatura ambiente por tempo indeterminado.Solução de TPTZ 10 mMDissolver 3,12 g de TPTZ em, aproximadamente, 5 mLde HCl 40 mM  e completar o volume para 1 L em umbalão volumétrico com HCl 40 mM, homogeneizar etransferir para um frasco de vidro âmbar devidamenteetiquetado. Armazenar sob refrigeração por até ummês.NNNNNNFe(III)NNN NNN+ antioxidante-eNNNNNNFe(II)NNN NNN3Metodologia Científica: Determinação da Atividade Antioxidante Total em Frutas pelo Método de Redução do Ferro (FRAP)Solução de Cloreto Férrico 20 mMDissolver 5,4 g de cloreto férrico em água destilada ecompletar o volume para 1 L em um balão volumétricocom água destilada, homogeneizar e transferir paraum frasco de vidro âmbar devidamente etiquetado.Armazenar sob refrigeração por até um mês.Tampão Acetato 0,3 M, pH 3,6Dissolver 3,1g de acetato de sódio em 16 mL de ácidoacético glacial e completar o volume para 1 L em umbalão volumétrico com água destilada, homogeneizar etransferir para um frasco de vidro âmbar devidamenteetiquetado. Armazenar em temperatura ambiente portempo indeterminado.Solução do Reagente FRAPO reagente FRAP é obtido a partir da combinação de25 mL de tampão acetato 0,3 M, 2,5 mL de umasolução de TPTZ 10 mM e 2,5 mL de uma soluçãoaquosa de cloreto férrico 20 mM, devendo ser usadoimediatamente após sua preparação.Solução Padrão de Sulfato Ferroso 2 mMDissolver 27,8 mg de sulfato ferroso em águadestilada e completar o volume para 50 mL em umbalão volumétrico com água destilada, homogeneizar etransferir para um frasco de vidro âmbar devidamenteetiquetado. Preparar e usar apenas no dia da análise.Curva-Padrão do Sulfato FerrosoPreparo das soluçõesA partir da solução padrão de sulfato ferroso (2.000µM), preparar em balões volumétricos de 10 mL,soluções variando a concentração de 500 µM a 1500 µM,conforme a Tabela 1.Tabela 1. Preparo das soluções para curva-padrão.Solução padrão Água Concentraçãode sulfato ferroso destilada final(mL) (mL) (µM)2,5 7,5 5005,0 5,0 1.0007,5 2,5 1.50010 0 2.000Determinação da Curva-PadrãoEm ambiente escuro, transferir uma alíquota de 90 µLde cada solução de sulfato ferroso (500 µM, 1.000 µM,1.500 µM e 2.000 µM) para tubos de ensaio, acres-centar 270 µL de água destilada e misturar com 2,7 mLdo reagente FRAP, homogeneizar em agitador de tubose manter em banho-maria a 37 oC. Realizar a leitura(595 nm) após 30 minutos da mistura e utilizar oreagente FRAP como branco para calibrar oespectrofotômetro.Plotar em planilha as concentrações de sulfato ferroso(mM) no eixo X e as respectivas absorbâncias no eixoY (Fig. 2) e calcular a equação da reta.Fig. 2. Exemplo de curva-padrão de sulfato ferroso.A partir da equação da reta (Fig. 2), calcular aabsorbância referente a 1000 mM de sulfato ferroso(Pulido et al., 2000), de acordo com a Equação 1.y = ax + bOnde,x = 1.000 µM de sulfato ferrosoy = Absorbância correspondente a 1.000  µM desulfato ferroso(Eq. 1)Protocolo do Método FRAPObtenção dos Extratos da FrutaEste procedimento foi adaptado de Larrauri et al.(1997). Como a concentração de compostosantioxidantes varia de fruta para fruta, fazem-senecessários testes prévios. Em análises realizadas noLaboratório de Fisiologia e Tecnologia Pós-Colheita, daEmbrapa Agroindústria Tropical, com diferentesfrutas, têm-se utilizado de 1 g a 25 g de amostra, deacordo com a fruta. Pesar a amostra em um béquer de100 mL, adicionar 40 mL de metanol 50%,homogeneizar e deixar em repouso por 60 minutos àtemperatura ambiente. Centrifugar a 25.406,55 g(15.000 rpm), durante 15 minutos, transferir oAbsorbância(595nm)Concentrações de sulfato ferroso (uM)4 Metodologia Científica: Determinação da Atividade Antioxidante Total em Frutas pelo Método de Redução do Ferro (FRAP)Exemplares desta edição podem ser adquiridos na:Embrapa Agroindústria TropicalEndereço: Rua Dra. Sara Mesquita 2270, Pici,CEP 60511-110 Fortaleza, CEFone: (0xx85) 3299-1800Fax: (0xx85) 3299-1803 / 3299-1833E-mail: negocios@cnpat.embrapa.br1a edição on line: dezembro de 2006Comitê dePublicaçõesExpedienteComunicadoTécnico, 125Presidente: Francisco Marto Pinto VianaSecretário-Executivo: Marco Aurélio da Rocha MeloMembros: Janice Ribeiro Lima, Andréa Hansen Oster,Antonio Teixeira Cavalcanti Júnior, José JaimeVasconcelos Cavalcanti, Afrânio Arley TelesMontenegro, Ebenézer de Oliveira Silva.Supervisor editorial: Marco Aurélio da Rocha MeloRevisão de texto: José Ubiraci AlvesEditoração eletrônica: Arilo Nobre de OliveiraNormalização bibliográfica: Ana Fátima Costa Pinto.Ministério daAgricultura, Pecuáriae Abastecimentosobrenadante para um balão volumétrico de 100 mL.A partir do resíduo da primeira extração, adicionar 40mL de acetona 70%, homogeneizar e deixar emrepouso por 60 minutos, à temperatura ambiente.Centrifugar novamente a 25.406,55 g (15.000 rpm)durante 15 minutos, transferir o sobrenadante para obalão volumétrico contendo o primeiro sobrenadante ecompletar o volume para 100 mL com água destilada.Determinação da Atividade AntioxidanteTotal (AAT)A partir do extrato obtido no item anterior, prepararem tubos de ensaio, no mínimo três diluições diferen-tes, em triplicata. Em ambiente escuro, transferir umaalíquota de 90 µL de cada diluição do extrato paratubos de ensaio, acrescentar 270 µL de água destilada,misturar com 2,7 mL do reagente FRAP, homogeneizarem agitador de tubos e manter em banho-maria a 37 oC.Realizar a leitura (595 nm) após 30 minutos da misturapreparada e utilizar o reagente FRAP como brancopara calibrar o espectrofotômetro.A partir das absorbâncias obtidas das diferentesdiluições dos extratos, plotar a absorbância no eixo Ye a diluição (mg/L) no eixo X. Em seguida, determinar aequação da reta. Para calcular a AAT, deve-se substi-tuir na equação da reta a absorbância equivalente a1.000 µM do padrão sulfato ferroso. O valor obtidopara o termo x (Eq. 2) corresponde à diluição daamostra (mg/L) equivalente a 1.000 µM de sulfatoferroso.y = ax + bOnde,y = Absorbância correspondente a 1.000  µM desulfato ferrosox = Diluição da amostra (mg/L) equivalente a 1.000 µMde sulfato ferroso(Eq. 2)X(g) = x / 1.000AgradecimentosAo Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico eTecnológico (CNPq) e à União Européia, pelo apoiofinanceiro - Projetos “Atividade antioxidante de frutasdo Nordeste brasileiro como fator de Proteção daSaúde” – CNPq Edital CT-Saúde/MCT/MS 030/2004 –Processo 506.633/2004-7 e “Producing added valuefrom under-utilised tropical fruit crops with highcommercial potential” - Sixth Framework Programme– Contrato 0015279, respectivamente.ReferênciasDEGASPARI, C.H.; WASZCZYNSKYJ, N. PropriedadesAntioxidantes de compostos fenólicos. Visão Acadêmica,Curitiba, v. 5, n. 1, p.33-40, 2004.LARRAURI, J.A.; RUPÉREZ, P.; SAURA-CALIXTO, F. Effect ofdrying temperature on the stabilitity of polyphenols andantioxidant activity of red grape pomace peels. Journal ofAgricultural and Food Chemistry, v. 45, p. 1390-1393, 1997.MOREIRA, E. A. M.; SHAMI, N. J. I. E. Licopeno como agenteantioxidante. Revista de Nutrição, Campinas, v. 17, n. 2,p.227-236, 2004.PULIDO, R.; BRAVO, L.; SAURA-CALIXTO, F. Antioxidantactivity of dietary as determined by a modified ferric reducing/antioxidant power assay. Journal Agriculture and Food Chemistry,v. 48, p. 3396-3402, 2000.THAIPONG, K.; BOONPRAKOB, U.; CROSBY, K; CISNEROS-ZEVALLOS, L.; BYRNE, D.H. Comparison of ABTS, DPPH,FRAP and ORAC assays for estimating antioxidant activityfrom guava fruit extracts. Journal of Food Composition andAnalysis, v.19, p.669-675, 2006.A partir do resultado encontrado (x) na equação 2,dividir por 1.000 para ter o valor em g. O resultadofinal (Eq. 3) é calculado pela divisão de 1.000 (µM)pelo valor de X(g) e multiplicado por 1(g) para encon-trar o valor final (Z) que é expresso em µM sulfatoferroso/g de fruta (porção comestível).(Eq. 3)Z = 1.000 / X(g).1

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