Material necessário. Reagentes. Vidrarias e outros. Procedimento. Planta-isca. Plantio. Documentação complementar. Atualizaçõesbitstream/CNPAB-2010/27330/1/doc105.pd

RUMJANEK, N. G.

Material necessário. Reagentes. Vidrarias e outros. Procedimento. Planta-isca. Plantio. Documentação complementar. Atualizaçõe

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                                                                                                             ISSN 0104-6187Dezembro, 19990Protocolo da Embrapa Agrobiologia para Isolamento deRizóbio a partir de Nódulo de Planta-IscaEmpresa Brasileira de Pesquisa AgropecuáriaAgrobiologiaMinistério da Agricultura e do AbastecimentoDocumentosNúmero, 105República Federativa do BrasilPresidenteFernando Henrique CardosoMinistério da Agricultura e do AbastecimentoMinistroMarcus vinicius Prantini de MoraesEmpresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária - EmbrapaDiretor PresidenteAlberto Duque PortugalDiretoresElza Ângela Battaggia Brito da CunhaDante Daniel Giacomelli ScolariJosé Roberto Rodrigues PeresEmbrapa AgrobiologiaChefe GeralMaria Cristina Prata NevesChefe Adjunto de Pesquisa e DesenvolvimentoSebastião Manhães SoutoChefe Adjunto AdministrativoVanderlei PintoDOCUMENTO  Nº 105     ISSN 0104-6187Dezembro 1999Protocolo da Embrapa Agrobiologia para Isolamento deRizóbio a partir de Nódulo de Planta-IscaNorma Gouvêa RumjanekSeropédica – RJ1999Exemplares desta publicação podem ser solicitadas à:Embrapa  AgrobiologiaCaixa Postal: 7450523851-970 – Seropédica – RJTelefone: (021) 682-1500Fax: (021) 682-1230e-mail: sac@cnpab.embrapa.brExpediente:Revisor e/ou ad hoc: Bruno José Rodrigues AlvesNormalização Bibliográfica/Confecção/Padronização: Dorimar dos Santos Felix                                                                                  e/ou Sérgio Alexandre LimaTiragem: 50 exemplaresComitê de Publicações: Sebastião Manhães Souto (Presidente)       Johanna Döbereiner       José Ivo Baldani       Norma Gouvêa Rumjanek       José Antônio Ramos Pereira       Robert Michael Boddey       Dorimar dos Santos Felix (Bibliotecária)Coordenadora Editorial: Érica Cruz Rosas de Oliveiraã EmbrapaRUMJANEK, N.G. Protocolo da Embrapa Agrobiologia para Isolamento deRizóbio a partir de Nódulo de Planta-Isca. Seropédica: EmbrapaAgrobiologia, dez. 1999. 8p. (Embrapa-CNPAB. Documentos, 105).ISSN 0104-6187     1.  Rhizobium.  I. Embrapa. Centro Nacional de Pesquisa de Agrobiologia(Seropédica, RJ). II. Título. III. Série.CDD 579.334S U M Á R I O1. OBJETIVO ................................................................................................42. MATERIAL NECESSÁR IO...........................................................................42.1 REAGENTES ..........................................................................................42.2 VIDRARIAS E OUTROS................................................................................53. PROCEDIMENTO........................................................................................53.1 PLANTA-ISCA ........................................................................................53.2 PLANTIO ...............................................................................................64. REFERÊNCIA BIBLIO GRÁFICA .................................................................84Protocolo da Embrapa Agrobiologia para Isolamento deRizóbio a partir de Nódulo de Planta-IscaNorma Gouvêa Rumjanek  11. OBJETIVOEstabelecer o procedimentos utilizados para o isolamento de rizóbio a partirde nódulo de planta-isca.2. MATERIAL NECESSÁRIO2.1 ReagentesÁgua oxigenada (100ml) H2O2Sulfato de magnésio hepta hidratado MgSO4.7H2OÁcido sulfúrico (100ml) H2SO4Sulfato de cobre penta hidratado CuSO4.5 H2OSulfato de zinco hepta hidratado ZnSO4.7 H2OÁcido bórico H3BO3Sulfato de ferro hepta hidratado FeSO4.7 H2OSulfato de manganês mono hidratado MnSO4. H2OMolibdato de sódio di hidratado Na2MoO4.2 H2OÁcido cítricoÁlcool comercial diluído 70% (200ml) -Água estéril -Sílica gel (suficiente para ocupar 1/3 dofrasco para estocagem de nódulos)-                                                 1 Pesquisadora, Embrapa Agrobiologia, Caixa Postal 74505,CEP 23.851-970, Seropédica - RJ52.2 Vidrarias e Outros· Erlenmeyer (250ml);· Solo;· Sementes;· Areia estéril (100g/por copo);· Recipiente plástico com furos para drenagem (300ml);· Algodão;· Fluxo laminar;· Placa de Petri (descasadas para colocar sob os copos e para realizar o plantiodas sementes esterilizadas)vidro hermeticamente fechado (50ml)· Malha plástica (nylon);· Pipetador automático e ponteira (1000ml e 100ml);· Câmara de crescimento;· Pinça;· Balança;· Etiqueta de identificação;· Papel alumínio;· Bastão de vidro.3. PROCEDIMENTO3.1 Planta-Isca3.1.1   A seleção da planta-isca depende do objetivo do estudo que está sendorealizado. Caupi (Vigna unguiculata) e siratro (Macropitilum atropurpurio) sãoespécies normalmente utilizadas porque nodulam com vários grupos de rizóbio.Espécies nativas da região em estudo também são recomendáveis. A escolha deleguminosas herbáceas apresenta vantagens sobre arbustivas ou árvores uma vez6que o crescimento mais rápido, acarreta em deficiência de nitrogênio o que vaiinduzir a formação de nódulos.3.1.2   Sementes devem ser selecionadas, eliminando aquelas que apresentem máformação e danos físicos.3.1.3   Sementes frágeis e pequenas, devem ser previamente esterilizadas em umerlenmeyer com a parte superior fechada com uma malha plástica trançada:3.1.1.1  Acrescentar um volume de álcool (70%) de modo que todas as sementesfiquem imersas;3.1.1.2   Agitar ligeiramente por 30 segundos e verter;3.1.1.3   Acrescentar água oxigenada por 3 minutos, vertendo em seguida;3.1.1.4   Proceder a lavagem com água estéril, agitando ligeiramente e dispensando;3.1.1.5   Repetir 10 vezes a lavagem.3.1.4   Para sementes que apresentam resistência a quebra de dormência, deve-seproceder inicialmente a escarificação:3.1.1.6   Agitar ligeiramente as sementes durante 1,5 minutos em álcool e descartá-lo;3.1.1.7   Acrescentar H2SO4 (concentrado) durante 6 minutos e descartá-lo;3.1.1.8   Acrescentar novamente álcool (70%), durante 2 minutos;3.1.1.9   Lavar 5 vezes com água estéril, agitando suavemente e descartando emseguida.OBS1 - Iniciar com um excesso de 20% de sementes. Após a esterilização/escarificação selecionar as sementes íntegras.3.2 PlantioEsterilizar os recipientes através da imersão em água sanitária por 30 minutos,rinsado, enxaguar com água estéril e secar ao ar.3.2.1.1 Nos recipientes devem conter um furo para drenagem e seremcolocados sobre placas de Petri estéril. Os recipientes devem ser colocados sobreuma mesa cuja superfície foi desinfestada com álcool (70%) e mantidos dentro decasa-de-vegetação.73.2.1.   Misturar 100g de solo destorroado com 100g de areia estéril. Colocar em umrecipiente com capacidade para 300ml (copo de plástico);Observar manutenção de condição de assepsia durante o período de cultivo;Manter um controle negativo, que consta: da mistura solo areia autocl vada (1::1)anteriormente ao plantio. São necessários tantos controles negativos quantas foremas espécies de planta-iscas utilizadas.OBS2: O solo deve ter sido coletado a menos do que 1 semana anterior ao plantio edurante este período deve ser mantido a temperatura ambiente3.2.2 Antes do plantio, irrigar a superfície do substrato com 10ml de água estéril porvaso. Após esta etapa, com auxílio de um bastão de vidro, fazer 5 covas e colocaras sementes com uma pinça e cobrir;3.2.3 Irrigar com água estéril sempre que necessário, colocando a água ou soluçãosempre na placa de Petri. Uma vez por semana acrescentar Solução deMicronutriente isenta de nitrogênio;OBS3: Usar 1ml desta solução por kg de solo. Conforme o solo usar 0,5g de MnSO4.H2O/litro (Solos Podzólicos).OBS4: Se aparecerem sinais de toxidade, diminuir a freqüência da adub ção.Observar ataque de pragas e/ou patógenos, e realizar tratamento com produtos decontato, tendo o cuidado de proteger a superfície do recipiente com papel alumínio.3.2.4 Verificar o aparecimento dos nódulos nas raízes com auxílio de uma espátulaflambada;3.2.5 Proceder a coleta da planta;3.2.6 Lavar o sistema radicular em água corrente, secar em papal absorvente ecoletar os nódulos;3.2.7 Preparar vidros contendo sílica gel recoberta com uma camada de algodão. Asílica gel deve estar seca, apresentando coloração azulada.8Colocar os nódulos sobre o algodão. Fechar hermeticamente. Sempre que a sílicase tornar rósea, trocar os nódulos para um frasco novo;Etiquetar.OBS5: As bactérias permanecem viáveis por pelo menos 1 ano, porém éinteressante se proceder ao isolamento num período de até 2 meses.OBS6: Quando já for conhecido previamente que a amostra de solo contém númeroreduzido de rizóbio, devem ser usadas diversos repetições com a mesma amostra,de forma a se obter um número razoável de nódulos (pelo menos 30).4. REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICABALDANI, V. L. D.; ANDRADE, V.O.; NEVES, M.C.P.; BARBOSA, A. L., PEIXOTO,R. C.; OLIVEIRA, E.C.R. Manual de Soluções e Reagentes da EmbrapaAgrobiologia. Seropédica: Embrapa Agrobiologia, 1999. 18p. (EmbrapaCNPAB. Documentos, 86).PEIXOTO, R.C. Manual de Boas Práticas para Laboratório. Seropédica: EmbrapaAgrobiologia, 1999. 52p. (Embrapa-CNPAB. Documentos, 87).FRANCO, A.A.; DÖBEREINER, J. Especificidade de hospedeiro na simbiose comRhizobio - Feijão e influência de diferentes nutrientes. Pesquisa AgropecuáriaBrasileira, Brasília, v.2, p. 467-474, 1967.

Protocolo da Embrapa Agrobiologia para isolamento de rizóbio a partir de nódulo de planta-isca.

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