CABRAL, G. B.

GANDER, E. S.

MARCELINO, L. H.

SANTOS, R. C. dos

Portuguese

Infoteca-e

1Transformaçâo de Algodão (Gossypium Hirsutum  L.) Através do Uso de PolicátionISSN 0100-6460CircularTécnicaCampina Grande, PBMaio, 200581AutoresTransformação de Algodão (Gossypium Hirsutum  L.)Através do Uso de PolicátionAs técnicas de transferência de genespara plantas através das ferramentasda engenharia genética, têm sidoutilizadas há mais de 20 anos e,desde então, várias característicasagronômicas foram incorporadas aculturas de importância econômica,sobretudo às oleaginosas e fibrosas,como soja, milho, canola e algodão(BORÉM e AZEREDO, 2003).No algodão, as principais demandasem termos de melhoria agronômica via transgenia, se centram nascaracterísticas das fibras, resistência a herbicidas e a  fitopatógenos, emparticular a insetos e fungos (KISER, 1995; MOREIRA et al., 1999); todavia,apesar das tecnologias atualmente disponíveis para transformação, a obtençãode plantas transgênicas de algodão ainda depende do tipo da cultivar e dométodo de transformação. Segundo Carvalho et al., (1998), nem todas ascultivares de algodão são embriogênicas e esta é uma das característicasnecessária para que se possa regenerá-las após a transformação.Além dessa limitação, o aparecimento de plantas anormais oriundas deembriões somáticos é muito comum o que prejudica o processo de obtençãoda planta transformada (SATYAVATHI et al., 2002).Entre as cultivares de G. hirsutum L., a mais utilizada para fins detransformação é a Coker 312 devido à competência para regeneração(CARVALHO, 1999; MOREIRA et al., 1999). Esta cultivar, contudo, não seadapta às condições fisiográficas brasileiras, de modo que os produtos delaobtidos necessitam de vários ciclos de hibridação e retrocruzamentos paraincorporação do transgene e manutenção das demais características jádefinidas na cultivar comercial. Devido a esses ciclos, todo processo naobtenção da cultivar transgênica demanda mais tempo, tornando-o tãodemorado quanto o do melhoramento convencional (MOREIRA et al., 1999;SAWAHEL, 2001).Carvalho et al., (1998) ajustaram um protocolo para obtenção deembriogênese somática na cultivar comercial CNPA Precoce I, da EmbrapaAlgodão, e obtiveram calos embriogênicos e, posteriormente, embrióides, nomesmo percentual que a Coker 312, abrindo-se daí uma oportunidade de seRoseane Cavalcanti dos SantosEngº, Agrº, Drª em BiologiaMolecular. da EmbrapaAlgodão, Campina Grande, PB,roseane@cnpa.embrapa.bGláucia Barbosa CabralEmbrapa Recursos Genéticos eBiotecnologia. SAIN- ParqueRural, W3 Final Norte, 70770-900, Brasília, DF. Lucília Helena MarcelinoEmbrapa Recursos Genéticos eBiotecnologia Eugen Silvano GanderEmbrapa Recursos Genéticos eBiotecnologia2 Transformaçâo de Algodão (Gossypium Hirsutum  L.) Através do Uso de Policátionconseguir plantas geneticamente modificadas destacultivar,  em tempo relativamente mais curto.Quanto aos métodos de transformação aplicados paraalgodão, os mais conhecidos e já estabelecidos sãoaqueles mediados por Agrobacterium ou porbiobalística. O método via Agrobacterium é simples e defácil manipulação, mas é aplicado a um número limitadode cultivares que podem ser regeneradas em plantasférteis através da embriogênese somática. A questão dalimitação deste método ocorre mais em função darelação patógeno-hospedeiro que devido à regeneração(FINER e MULLEN, 1990; RAJASEKHARAN et al.,1996; SATYAVATHI et al., 2002); o método debiobalística é mais oneroso e sua eficiência depende docontrole de alguns fatores ligados à técnica, comotamanho dos microprojéteis, resistência ao vácuo, forçade propulsão e uniformidade na superfície do tecidoalvo. Segundo Milki et al., (1993), o controle de todosesses fatores é difícil entre e dentro do experimento,dificultando, a comparação do nível de expressão gênicaentre tecidos; além dessas metodologias, uma outratécnica de transferência de DNA de uma célula a outravem sendo desenvolvida, a de uso de policátion.O uso de policátions (poliethilenoglicol - PEG, polivinilálcool - PVA etc) na transferência de genes é feito desdeo início da década de 80, tanto em células vegetaiscomo em fumo (PASZKOWSKI et al., 1984), milho(ANTONELLI e STADLER, 1989), arroz (TSUGAWA etal., 1998) e algodão (SAWAHEL, 2001), quanto emcélulas animais (WAGNER et al., 1990; KABANOV etal., 1993).A característica desse método se baseia no uso daspropriedades químicas do policátion que se ligaefetivamente ao DNA, por ser este negativamentecarregado. A eficiência na transferência do DNAmediado por policátions baseia-se no aumento dapermeabilidade da membrana, facilitando a entrada docomplexo na célula e na proteção que o polímerofornece ao DNA contra ação de nucleases.Sawahel (2001) desenvolveu um protocolo simplespara transformação de calos de algodão G. barbadenseL., utilizando como fonte de policátion, o brometo dehexadimetrina (polibrene). Este protocolo foi utilizadopor pesquisadores da Embrapa para transformar G.hirsutum L.; contudo, a eficiência de transformantes foibaixa, razão porque se procederam a alguns ajustes noprotocolo que possibilitaram resultados maisexpressivos, conforme descritos a seguir.Metodologia de transformaçãoIndução de calos: Sementes deslintadas de G. hirsutumcv. Coker 312 foram desinfetadas como descrito porSawahel (2001) e cultivadas em meio basal MSB sólido(MURASHIGE e SKOOG, 1962), mais 3% de sacarosee suplementado com 10 mg/L de 2,4-D (ácido 2,4-dicloro fenoxiacético) e 0,5 mg/L de 2-ip(isopenteniladenina) (CARVALHO et al., 1998). O meiofoi solidificado com 0,16% de Phytagel. Sete dias apósa germinação das sementes, o hipocótilo de cadaplântula foi cortado em fragmentos de 5 mm2 einoculados no meio MSB sólido em magentas, queforam incubadas a  27± 2 °C, sob condições de 16hde luz e 8h de escuro.DNA plasmidial: Utilizou-se o vetor binário pCAMBIA1301, que contém o gene marcador gusI, e o deseleção hpIIt, ambos sob o controle do promotor 35Sdo CaMV ( Cauliflower Mosaic Vírus).Protocolo de transformação: Calos da cultivar Coker312 (200 mg) foram submetidos a pré-plasmólisedurante 4 horas em microtubos (1,5 mL) contendo 1 mLde tampão fosfato, pH 7, cuja solução era trocada acada hora e mantidos a temperatura ambiente; a seguir,os calos foram centrifugados a 402 x g (eppendorf,mod. 5402), durante 2 min e ressuspendidos emsolução contendo 300 mL de MSB líquido aos quaisforam adicionados 200 mL de espermidina 0,5 M. Afonte de policátion utilizada foi  polibrene,  preparado naconcentração de 0,3 mg/mL em MSB líquido eadicionado ao meio MSB/espermidina contendo oscalos; depois,  adicionou-se o DNA plasmidial àconcentração de 50 mg/mL em 400 mL MSB líquido,adicionando-o à solução final MSB/espermidina/polibrene. A mistura total foi colocada em agitador por20 min e, posteriormente, incubada a 28°C/6h. Depoisdesse período, cada amostra foi transferida para placasde petri (Corning 35mm), contendo 4 mL de MSB3Transformaçâo de Algodão (Gossypium Hirsutum  L.) Através do Uso de Policátionlíquido e incubadas por dois dias, a 28°C.Expressão transiente do gene gus: Depois da incubaçãodos calos cada amostra foi filtrada, coletando-se 100mg de calos, os quais foram transferidos para placa deELISA e incubados a 37 °C durante 19 hs em soluçãocontendo X-gluc (5-bromo-4-cloro-3-indolil-b-D-glucoronídeo), na concentração de 50 mg/mL, paraanálise histoquímica do gus (BRASILEIRO e CARNEIRO,1998). Dez calos foram testados para cada tratamento eas amostras analisadas com auxílio de microscópioestereoscópico.Seleção em higromicina: Os calos remanescentes (100mg) foram transferidos para meio MSB sólido contendo50 mg/L de higromicina. Em cada magenta distribuíram-se dez calos, que foram cultivados durante 60 dias, emcâmara de crescimento, no escuro. Cada tratamento teveseis repetições.Análise de PCR: Utilizaram-se os calos crescidos emmeio contendo higromicina  para análise via PCR. Oprotocolo de extração de DNA usado foi o descritoBrasileiro e Carneiro (1998). Para a reação de PCR (25mL), empregou-se 1 mL de DNA (10 ng/mL) extraído decada tratamento de acordo com metodologia descrita porBrasileiro e Carneiro (1998). Oligonucleotídiosespecíficos do gene hptII foram utilizados. As condiçõesde PCR foram: um ciclo de desnaturação a 94 °C/5min, 35 ciclos de desnaturação (94 °C/1 min):anelamento (55 °C/1 min); extensão (72 °C/1 min) eum ciclo final de extensão a 72 °C/5 min. Os produtosobtidos foram submetidos à eletroforese em gel deagarose (0,8 %) contendo brometo de etídio (1%) eposteriormente visualizados em sistema defotodocumentação (Eagle-eye).Southern blot: Os produtos de PCR dos calostransformados com o vetor pCAMBIA 1301 foramtransferidos para membrana Hybond-N-Nylon(Amersham Life ScienceR ) através de Vacuum blotter(Bio-Rad) por 2 horas; em seguida, fixou-se os produtosà  membrana com auxílio de um Crosslinker  por 30seg. Um fragmento do gene hptII contendo 480 pb foiusado como sonda e marcado com  a P32 dCTP. Asonda foi preparada utilizando-se o kit random primed-DNA-labeling (Pharmacia). A hibridização ocorreu a 65°C durante 18h em tampão SSPE 6X (NaCl2 0,9M +NaPO4  60 mM pH 7,6 + EDTA 6 mM + SDS 0,5% +solução de Denhardt 5X e 100 mL de DNA esperma desalmão, previamente denaturado). Após a hibridização, amembrana foi lavada duas vezes em tampão SSPE 2X/SDS 0,1% por 20 min a temperatura ambiente, umavez em SSPE 1X/SDS 0,1% por 15 min a 65 °C euma vez SSPE 0,1X/SDS 0,1% por 15 min 65 °C. Aseguir, a membrana foi exposta a filme de raio X por18 h a - 70°C.Resultados obtidosMeio de indução de calosO meio de cultivo de algodão empregado neste trabalho,possibilitou  a proliferação de calos friáveis de maneirauniforme e em quantidade suficiente para as etapasnecessárias nos ensaios de transformação. Em ensaiosprévios, em que adotou-se o protocolo descrito porSawahel (2001), utilizando-se 1% de sacarose e apenasuma auxina (2,4-D) como regulador de crescimento,observou-se lento crescimento dos calos e aceleradaoxidação devido ao alto teor de compostos fenólicosque, normalmente, a planta de algodão possui. Com oajuste do protocolo, a elevação da concentração desacarose (3%) e, em especial, a adição ao meio de umacitocinina (2ip) possibilitaram expressivo crescimentodos calos de algodão, tanto em quantidade como emprecocidade (Figura 1).Fig. 1. Detalhe de calos crescidos em MS acrescido de sais,vitaminas, sacarose (3%), auxina (2,4-D) e citocinina (2-ip)Expressão do gene gusNa análise histoquímica do gene gus verificou-se grandequantidade de calos transformados, revelada pela reaçãoenzimática com X-Gluc (Figura 2). Dos dez calos4 Transformaçâo de Algodão (Gossypium Hirsutum  L.) Através do Uso de Policátiondetecção do gene hptII.  O fragmento interno, deaproximadamente 500 pb, confirmou a presença dorespectivo gene do pCAMBIA nos calos transformados(Figura 3A); a presença do vetor foi confirmada atravésda sonda de hptII  em análise de Southern blot  (Figura3B).testados, a reação foi positiva em sete. Em ensaiosprévios com a Coker 312, observou-se baixa expressãodo gus quando o vetor pCAMBIA 1301 foi utilizado namesma concentração descrita em Sawahel (2001), de30 mg/mL. Do total de dez calos testados, em apenasum  se detectou reação positiva.Seleção em higromicinaA taxa de crescimento dos calos em 50 mg/mL dehigromicina foi baixa devido, provavelmente, à altaconcentração desse antibiótico, fazendo com que seelevasse a pressão de seleção dos transformantes; aindaassim, em cada repetição se constataram entre 50% e60% de crescimento desses calos, enquanto os calosdos tratamentos controle (sem plasmídio) que foraminoculados em meio com higromicina, não cresceram nomeio seletivo. Em ensaios de expressão em que seutiliza o gene htpII, a concentração verificada naliteratura se situa entre 7.0 e 40 mg/mL (STRIZHOV etal., 1996; PONNAPA et al., 1999; CHOI et al., 2000).Em seu trabalho de Sawahel (2001), procede à seleçãodos transformantes com 100 mg/mL de higromicina;esta concentração é muito elevada podendo incorrer emdescarte de transformantes positivos, em virtude de nãosuportarem a forte pressão de seleção, em função daquantidade de antibiótico encontrada no meio decrescimento.Análises de PCR e  de Southern blotConstataram-se produtos de PCR amplificados paraFig. 2. Expressão de gus em calos transformados com ovetor pCAMBIA 1301 Esquerda: Calos de algodão crescidoem MSB/espermidina/polibrene (controle). Direita: Calos dealgodão transformados, mostrando reação enzimáticapositiva para o gus.Fig. 3. Produto de PCR em gel de agarose (0.8%).  M-Marcador de peso molecular: 1Kb DNA ladder Plus. 1- DNAde calos de plantas não transformadas (controle); 2- DNAde calos transformados com pCAMBIA 1301; 3- sonda  dogene hptII (500pg/mL). Seta indica o fragmento de ~ 500pb de hptII. B- Auto-radiografia de Southern blot. 1- DNA decalos transformados com pCAMBIA 1301; 2- fragmentocorrespondente à sonda do gene hptII.Os resultados apresentados nesse estudo demonstram aaplicabilidade e facilidade do uso da técnica depolicátions para transformação em algodão G. hirsutumL. No trabalho de Sawahel (2001) a eficiência detransformação em G. barbadense situou-se em 4,4%,considerando-se o número de transformantes/mg DNA.Aqui, não se estimou a eficiência de transformação;contudo, com o ajuste demonstrado no protocolo,descrito por Sawahel (2001) para G. hirsutum sugere-seque a eficiência de transformação possa situar-se nessemesmo nível ou brevemente superior.ConclusãoA técnica de transformação de algodão através do usode polibrene é de grande simplicidade, rápida e comcustos equivalentes aos dependidos com a deAgrobacterium; ela apresenta, ainda, a vantagem de sermenos tóxica que outros policátions, a exemplo do PEGe é perfeitamente adaptável a qualquer outra cultura,desde que se estabeleçam as condições para obtençãode calos viáveis.5Transformaçâo de Algodão (Gossypium Hirsutum  L.) Através do Uso de PolicátionReferências BibliográficasANTONELLI, N.M.;  STADLER, J. Chemical methods fordirect gene transfer to maize protoplasts: I. 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GomesRevisão de Texto: Nisia Luciano LeãoTratamento das ilustrações: Geraldo F. de S. FilhoEditoração Eletrônica: Geraldo F. de S. Filho

Transformação de algodão (Gossypium Hirsutum L.) através do uso de policátion.

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Transformação de algodão (Gossypium Hirsutum L.) através do uso de policátion.

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