ALVES, M. F.

BARROSO, P. A. V.

FREITAS, R. B. de

HOFFMANN, L. V.

Portuguese

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1Aplicabilidade de Marcadores SSR em Estudos Genéticos em Gossypium mustelinum MiersComunicadoTécnico345ISSN 0102-0099Novembro/2007Campina Grande, PB1 Eng. Agrôn., D.Sc., da Embrapa Algodão, Rua Osvaldo Cruz, 1143, Centenário, CEP 58.107-720, Campina Grande, PB. E-mail:pbarroso@cnpa.embrapa.br1 Eng. Agrôn., D.Sc., da Embrapa Algodão. E-mail: hoff@cnpa.embrapa.br2 Mestranda da Universidade de Federal do Rio Grande do Norte - Natal - RN. E-mail: milenafalves@yahoo.com.br3 Graduando em Ciências Biológicas, UEPB, estagiário da Embrapa Algodão. E-mail: rodolfobfreitas@hotmail.comAplicabilidade de Marcadores SSR emEstudos Genéticos em Gossypiummustelinum MiersPaulo Augusto Vianna Barroso1Lúcia Vieira Hoffmann1Milena Ferreira Alves2Rodolfo Barbosa de Freitas3O interesse acerca do estudo e da preservação dabiodiversidade tem aumentado, principalmentedevido à necessidade de novas fontes devariabilidade genética. Essa variabilidade é utilizadapara suprir carências de genes ausentes dentro dopool gênico adaptado e que controlamcaracterísticas de herança simples com elevadaimportância agronômica, como por exemplo, aresistência a algumas doenças, ou para ampliar abase genética de caracteres complexos, como aprodutividade. O caso do algodão não é diferente,pois os ganhos contínuos em produtividade atingidosnos últimos anos podem ser reduzidos ou deixaremde ocorrer, caso a diversidade usada nos programasde melhoramento do algodoeiro não seja ampliada.Uma espécie de algodão que poderia representaruma valiosa fonte de variabilidade genética seriaGossypium mustelinum Miers.G. mustelinum, a única espécie de algodãoendêmica do Brasil, é típica de matas ciliares,existindo como séries de indivíduos dispersos nasmargens de lagos e riachos, em algumas regiões doNordeste (BARROSO et al., 2005). Entretanto, aespécie nunca sofreu nenhum tipo de seleção ouexploração comercial (BARROSO e FREIRE, 2003),sendo, assim, ainda pouco conhecida. BARROSO etal. (2006), estudando alguns indivíduos, verificaramsignificativo número de alelos exclusivos, entretanto,demonstraram que esta espécie apresenta baixadiversidade genética e elevada endogamia. A baixadiversidade associada a riscos que está sujeita emcampo, resultam em alta vulnerabilidade da espécie.Marcadores do tipo SSR (Simple Sequence Repeats)consistem de um a seis pares de bases,  cujasseqüências se repetem em tandem (uma atrás daoutra) ao longo do genoma. O número de repetiçõesé altamente polimórfico, e podem ser analisados pelautilização de um par de iniciadores específicoscomplementares às seqüências que flanqueiam oSSR e que, ao contrário, são altamente conservadas.Segmentos amplificados a partir desses sítios sãomuito variáveis, com alelos que se distinguem porum número diferente de unidades repetitivas,refletidas por diferenças de tamanho, medidas empares de bases. Locos SSR possuem expressãocodominante, ou seja, ambos os alelos de um2 Aplicabilidade de Marcadores SSR em Estudos Genéticos em Gossypium mustelinum Miersindivíduo heterozigoto são visualizados. Estesmarcadores moleculares têm sido utilizados nos maisdiversos campos do estudo genético de espéciescultivares e selvagens, como na identificação deorigem parental, atribuição de linhagens, construçãode mapas genéticos, avaliação do germoplasma epopulações de melhoramento e na estimativa desimilaridade ou diversidade genética. Neste aspecto,marcadores SSR têm sido intensamente utilizadospara estimar a diversidade genética de algodão(ALMEIDA, 2007; BERTINI, et al., 2006; LACAPEet al., 2007). Além de estudos visando traçarestratégias adequadas para a conservação in situ eex situ de G. mustelinum, marcadores SSR podemauxiliar na definição de métodos de introdução davariabilidade da espécie nos programas demelhoramento. Para isso, um grande número deprimers deve ser usado para que um perfil genéticoadequado possa ser utilizado em estudos demapeamento e genômicos visando à realização deseleção assistida por marcadores.Este trabalho teve como objetivo determinar osalelos SSR de indivíduos de G. mustelinum presentesem localidades da região semi-árida do Nordeste.Este estudo avaliou genótipos de G. mustelinum commarcadores SSR para verificar a aplicabilidadedestes marcadores em estudos de mapeamento e dediversidade genética em que a espécie estiverenvolvida.Resultados e DiscussãoO DNA de dez indivíduos foi extraído a partir desementes segundo procedimento desenvolvido porShuster et al. (2004). As reações PCR paraamplificação dos alelos SSR foram realizadassegundo (NGUYEN, et al. 2004) e a coloração dosgéis denaturantes de poliacrilamida 5% foi realizadasegundo Creste et al. (2001). Foram analisados 53pares de primers cujas seqüências foramdesenvolvidas pelo CIRAD (CIR) ou no BrookhavenNational Laboratory (BNL), que amplificaram 61locos, dos quais 34 foram polimórficos (58%) entreos acessos incluídos no estudo (Tabela 1). Os pesosmoleculares dos alelos variam de 98 pb a 316 pb eas diferenças entre os alelos de um mesmo loco foide dois a 29 pares de bases. A Figura 1 apresentaum gel de poliacrilamida demonstrando o padrão deamplificação do primer CIR 203 e os novos alelosContinua...Tabela 1. Tamanho, em pares de bases, dos alelosamplificados no conjunto de genótipos de G.mustelinum e dos alelos descritos na base de dadosCDM, segundo o primer.3Aplicabilidade de Marcadores SSR em Estudos Genéticos em Gossypium mustelinum MiersTabela 1. Continuação...Continua...Tabela 1. Continuação...Continua...4 Aplicabilidade de Marcadores SSR em Estudos Genéticos em Gossypium mustelinum Miersencontrados em Gossypium mustelinum. Os primersCIR 222, 039, 048 e 141, e BNL 3147, 2634,3449, 448, 3895 amplificaram mais de um loco. Onúmero médio de alelos por loco foi 1.77, com valormáximo de quatro e mínimo de um alelo. Os primersque amplificaram o maior número de alelos foram oCIR 049 e o BNL 3835, que geraram quatro alelos.Os alelos amplificados foram comparados aosdescritos no Cotton Microsatellite Database - CDM(BLENDA et al., 2006), um banco de dados demarcadores SSR desenvolvidos para algodão,utilizados para analisar as diferentes espéciescultivadas e exóticas do gênero. Quarenta alelos nãodescritos no CMD para G. mustelinum foramencontrados. Este elevado valor foi atribuído aomaior número de indivíduos avaliados neste estudo.O primer CIR 020, que não foi incluído no painelapresentado no CMD, caracterizou apenas um alelode 165pb no presente estudo. Do mesmo modo, oprimer CIR 034 não apresentou resultadosanteriores para G. mustelinum, mas foramencontrados 141pb no presente estudo.Apesar de G. mustelinum não apresentarcaracterísticas agronômicas e de fibras adequadas,possui genes que podem contribuir para a melhoriados cultivares de algodoeiro herbáceo. Não épossível usar diretamente os acessos de G.mustelinum como genitores de populações demelhoramento, pois seus descendentesapresentariam características indesejáveis emcultivares. É necessária uma etapa intermediária,em que os genes de interesse sejam transferidospara genótipos sem graves defeitos. Este pré-melhoramento pode ser realizado de modo maiseficiente caso seja possível acompanhar asegregação dos genes que controlam ascaracterísticas para as quais se deseja aumentarvariabilidade de G. mustelinum. O acompanhamentopode ser realizado, caso se identifique um marcadormolecular que co-segregue com genes de interesseagronômico. Para isso é necessário que um mapagenético baseado em marcadores moleculares entreG. mustelinum e G. hirsutum r. latifolium sejaconstruído ou que estudos de associação sejamrealizados. Como os alelos encontrados em G.mustelinum foram, quase sempre, diferentes dosrelatados para G. hirsutum r. latifolium no CMD,marcadores SSR devem permitir que mapasgenéticos saturados sejam construídos com relativafacilidade e que associações sejam encontradasentre marcadores e genes de interesse.Os marcadores também podem ser usados paraquantificar a diversidade genética da espécie, o quedefine o número de acessos a serem mantidos nosbancos de germoplasma e o modo como procedernas multiplicações de sementes quando as taxas degerminação atingirem o limite crítico. Além disso,eles pode ser empregado para determinar como adiversidade está estruturada entre e dentro daspopulações naturais. Esta informação é importante,pois permite determinar o número de populaçõesTabela 1. Continuação...Fig. 1. Gel de poliacrilamida demonstrando o padrão deamplificação do primer CIR 203 e os novos alelosencontrados em Gossypium mustelinum.5Aplicabilidade de Marcadores SSR em Estudos Genéticos em Gossypium mustelinum Miersque devem ser preservadas e identificar quaisdevem ser priorizadas. A presença de alelosdiferentes entre os acessos de G. mustelinum em58% dos locos qualifica os marcadores SSR paraestudos de diversidade na espécie. Os marcadoresque apresentaram o maior número de alelos devemser preferidos para realizar o estudo das populações,pois permitirão identificar com maior precisão asdiferenças entre e dentro das populações.ConclusãoOs marcadores SSR são adequados para realizarestudos genéticos em que acessos de Gossypiummustelinum estiverem envolvidos.Referências BibliográficasALMEIDA, V. C. Caracterização genética e in situde Gossypium barbadense na região norte do Brasil.2007. 67 f. 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Disponível em:  <http://icgi.tamu.edu/meeting/2006/p2.html>. Acesso em:set. 2007.BERTINI, C. H. C. M.; SCHUSTER, I.; SEDIYAMA,T.; BARROS, E. G.; MOREIRA, M. Characterizationand genetic diversity analysis of cotton usingmicrosatellites. Genetics and Molecular Biology,Ribeirão Preto, v. 29, p.321-329, 2006.BLENDA, A.; SCHEFFLER, J.; SCHEFFLER, B.;PALMER, M.; LACAPE, J. M.; YU, J. Z.;JESUDURAI, C.; JUNG, S.; MUTHUKUMAR, S.;YELLAMBALASE, P.; FICKLIN, S.; STATON, M.;ESHELMAN, R.; ULLOA, M.; SAHA, S.; BURR, B.;LIU, S.; ZHANG, T.; FANG, D.; PEPPER, A.;KUMPATLA, S.; JACOBS, J.; TOMKINS, J.;CANTRELL, R.; MAIN, D. CMD: A CottonMicrosatellite database resource for gossypiumgenomics. BMC Genomics. v. 7,  p. 132, 2006.CRESTE, S., TULMANN NETO, A.; FIGUEIRA, A.Detection of single sequence repeat polymorphismsin denaturing polyacrylamide sequencing gels bysilver staining.  Plant Molecular Biology Reporter.Athens, v. 19, p. 1-8, 2001.LACAPE, J. 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Determinaçãoda pureza varietal de sementes de soja com o auxíliode marcadores moleculares microssatélites.Pesquisa Agropecuária Brasileira, Brasília, DF, v. 39,p. 247-253, 2004.6 Aplicabilidade de Marcadores SSR em Estudos Genéticos em Gossypium mustelinum MiersComunicadoTécnico, 345Exemplares desta edição podem ser adquiridos na:Embrapa AlgodãoRua Osvaldo Cruz, 1143 Centenário, CP 17458107-720 Campina Grande, PBFone: (83) 3315 4300 Fax:  (83) 3315 4367e-mail: sac@cnpa.embrapa.br1a EdiçãoTiragem: 500Comitê dePublicaçõesPresidente: Nair Helena Castro ArrielSecretária Executiva: Nivia Marta Soares GomesMembros: Demóstenes Marcos Pedroza de AzevêdoEveraldo Paulo de MedeirosFábio Aquino de AlbuquerqueFrancisco das Chagas Vidal NetoJoão Luiz da Silva FilhoJosé Wellingthon dos SantosLuiz Paulo de CarvalhoNelson Dias SuassunaExpedientes: Supervisor Editorial: Nivia Marta Soares GomesRevisão de Texto: Nisia Luciano LeãoTratamento das ilustrações: Oriel Santana BarbosaEditoração Eletrônica: Oriel Santana Barbosa

Aplicabilidade de marcadores SSR em estudos genéticos em Gossypium Mustelinun Miers.

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Aplicabilidade de marcadores SSR em estudos genéticos em Gossypium Mustelinun Miers.

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