CARVALHO, J. M. F. C.

JERÔNIMO, J. F.

PINHEIRO, M. P. N.

SANTOS, J. W. dos

VIDAL, M. S.

Infoteca-e

1Indução de Calos a partir de Embriões Zigóticos Imaturos em Duas Cultivares de AlgodãoComunicadoTécnico265ISSN 0102-0099Dezembro/2005Campina Grande, PBIndução de Calos a partir de EmbriõesZigóticos Imaturos em Duas Cultivaresde AlgodãoMárcia Soares VidalJulita Maria Frota Chagas CarvalhoJosé Wellington dos SantosMorganna Pollynne Nóbrega PinheiroJeane Ferreira JerônimoVários protocolos têm sido explorados visando àtransformação de algodão, incluindo, o uso doAgrobacterium, utilizando células meristemáticas(GOULD et al., 1991), cotilédones (FIROOZABADYet al., 1987), hipocótilo (UMBECK et al., 1987),calos embriogênicos (LEELAVATHI et al., 2004), ouso de biobalística (RAJASEKARAN et al., 2000) e ouso de transformação via tubo polínico (ZHOU et al.,1983). Embora todos esses protocolos tenham sidorelatados, a regeneração e a transformação doalgodão são genótipos dependentes, sendoextremamente difíceis de atingir o sucesso natransformação, devido à presença de várioscomponentes orgânicos no algodão, particularmente,a presença de polifenóis, que dificultam o processode regeneração. Com base nisso e no fato de quealguns métodos de regeneração/transformaçãoapresentarem-se genótipo específicos, as pesquisasnesta área ainda continuam, a fim de obter umametodologia que não se mostre genótipo específica eque aumente o recuperação de transformantes dealgodão.A embriogênese somática é considerada uma dasestratégias mais eficazes de regeneração etransformação do algodoeiro, apesar de seu carátergenótipo-dependente. A transformação de célulasembriogênicas, capazes de regenerar uma plantainteira, garante a transferência dos genes exógenosà sua progênie e diminui as chances de ocorrênciade plantas quiméricas (WILKINS et al., 2000).A fim de viabilizar a transformação de qualquervariedade de algodão por embriogênese somática,os protocolos de regeneração existentes têm sidoaperfeiçoados através da manipulação dascondições de cultura (microambiente) e dos fatoreshormonais e nutricionais do meio de cultivo e,emprego de explantes distintos dos que até entãovem sendo utilizados, como explantes de hipocótilo,1Bióloga, DSc. em Genética, Embrapa Algodão, CP 174, CEP 58107-720, Campina Grande, PB. E-mail: mvidal@cnpa.embrapa.br2Eng. Agr., DSc. em Recursos Fitogenéticos, Embrapa Algodão. E-mail: julita@cnpa.embrapa.br3Eng. Agr., MSc. em Estatística, Embrapa Algodão. E-mail: jwsantos@cnpa.embrapa.br4Estagiária da Universidade Estadual da Paraíba, CEP 58109-753, Campina Grande, PB.5Mestranda do Curso de Pós-Graduação em Engenharia Agrícola da UFCG.2 Indução de Calos a partir de Embriões Zigóticos Imaturos em Duas Cultivares de Algodãopor exemplo. Além disso, a identificação maisprecisa dos diferentes tipos de calos possibilita aseleção apenas dos calos com potencialembriogênico, os quais poderão ser utilizados comsucesso na transformação de algodão viaAgrobacterium, aumentando, assim, a freqüência detransformação.De maneira geral, para a obtenção de embriõessomáticos de algodão, segmentos de hipocótilo ecotilédone são cultivados em meio MS básico(MURASHIGE e SKOOG, 1962), contendoconcentrações adequadas de auxina e citocinina(principalmente 2,4-D e cinetina, respectivamente).A etapa inicial consiste na indução da calogênese,na qual uma massa de calos friáveis dará origem aregiões embriogênicas. Nessa fase, porém, não seutiliza nenhum regulador de crescimento. A fim deaumentar a eficiência de regeneração de plantas,diversos fatores e condições de estresse têm sidointroduzidos durante a produção e amadurecimentode embriões globulares. A adição de altas doses deKNO3, por exemplo, e o enriquecimento dos meiosde embriogênese com os aminoácidos glutamina easparagina foram associados à alta eficiência deprodução de embriões somáticos em algunsprotocolos descritos na literatura (MISHRA et al.,2003; IKRAM-UL-RAQ et al., 2004; WU et al.,2004). Além disso, a dessecação tem sido utilizadapara promover a maturação e a germinação deembriões no estádio cotiledonar (KUMRIA et al.,2003; CHAUDHARY et al., 2003).Nos últimos anos, portanto, o sistema deembriogênese somática tem tido grandes avanços,os quais permitiram a regeneração de algumasespécies selvagens do gênero Gossypium (SUN etal., 2003), de variedades chinesas de G. hirsutum(ZHANG et al., 2001; WU et al., 2004), além dascultivares tradicionais da linhagem Coker (KUMRIAet al., 2003; CHAUDHARY et al., 2003; IKRAM-UL-HAQ E ZAFAR, 2004).Diante disso, o presente trabalho teve por objetivoavaliar a indução de calos embriogênicos a partir deembriões zigóticos das cultivares de algodão CNPAITA-90II e BRS-CEDRO para posterior emprego natransformação genética via agrobactéria.Este trabalho de pesquisa foi desenvolvido nolaboratório de Cultura de Tecidos parte integrantedo Laboratório de Biotecnologia da Embrapa Algodão– CNPA, localizada na cidade de Campina Grande,PB. Maçãs com 20 dias de desenvolvimentocoletadas de plantas da cultivar de algodão CNPAITA-90II mantidas em casa-de-vegetação foramselecionadas e levadas ao laboratório, onde foramlavadas e desinfestadas com solução de hipocloritode sódio a 2,5% e, em seguida, enxaguadas trêsvezes com água deionizada estéril. Destas maçãsforam extraídos os explantes, que foram então,cultivados em frascos de cultura contendo meio paraa indução de calos, que consistia do meio MS básicosuplementado com as combinações dos hormôniosisopentenil-adenina (2iP) e 2,4-Ddiclorofenoxiacetato de sódio (2,4D), nas seguintesconcentrações respectivamente, 0,1 mg.L-1 e, 0,5;1,0; 2,0 e 4,0 mg.L-1, 3% de glicose e 0,2% defitagel, pH 5,8. Como tratamento testemunha foiempregado o meio MS sem hormônios (MIE0).Foram utilizados 18 frascos com cinco embriõeszigóticos para cada meio testado. Os frascos forammantidos por 60 dias num fotoperíodo de 16h de luz/8h de escuro, para desenvolvimento dos calos. Apóseste período, foram avaliados: o número deexplantes que desenvolveram calos, bem como, onúmero de explantes que desenvolveram plântulas eque necrosaram. Os dados foram analisadosmediante o procedimento “General Linear Model(GLM)” do SAS.Os resultados da indução de calos em meio MSsuplementado com quatro concentrações de 2iP euma concentração de 2,4-D, formado a partir deembriões zigóticos imaturos com 20 dias dedesenvolvimento, estão apresentados na Tabela 1,onde não foi observada diferença nas variáveisanalisadas entre as cultivares estudadas.Foi observado que dos quatro tratamentos testados,o tratamento que produziu o maior número deexplantes calejados foi o MIE1 (MS + 0,1 mg.L-1 de2,4D + 0,5 mg.L-1 de 2iP), com cerca de 2,51explantes com calos (Figura 1). Foi observado umelevado número de explantes necrosados para todosos tratamentos; no entanto, foi observada diferençasignificativa entre o meio MIE1 e os demais, onde foipossível observar um menor número de explantesnecrosados, cerca de 6,78 explantes necrosados.3Indução de Calos a partir de Embriões Zigóticos Imaturos em Duas Cultivares de AlgodãoDe posse dos calos, estes foram transferidos parameio MS livre de hormônios para o desenvolvimentodos mesmos, os quais serão avaliadoshistologicamente quanto a sua potencialidade emgerar embriões somáticos.Com os resultados gerados neste trabalho pode-seconcluir:• Não houve diferença entre as cultivares paranenhuma das variáveis analisadas• Verificou-se diferença significativa entre os meiospara todas as variáveis em estudo, destacando omeio MIE1 para as variáveis calos e, calos comdesenvolvimento de plântula• Contatou-se que a indução de calos foi maisresponsiva quando foi empregado o meio MIE1 (MSsuplementado com 0,1 mg.L-1 de 2,4D e 0,5 mg.L-1de 2iP)Referências BibliográficasCHAUDHARY, R.; KUMAR, S.; PRASAD, K.V.S.K.;OINAM, G.S.; BURNA, P.K. e PENTAL, D. Slowdesiccation leads to high-frequency shoot recoveryfrom transformed somatic embryos of cotton(Gossypium hirsutum L. cv. Coker 310 FR). PlantCell Rep., 21: 955-960, 2003.DENG-D.W.; GUO-S.D.; YANG-Z.M. Study on themolecular cytological mechanism of cottontransformation by pollen tube pathway. Scientia-Agricultura-Sinica, v. 32(6), p. 113-114, 1999.FIROOZABADY, E.; DeBOER, D.L.; MERLO, D.J.;HALK, E.L.; AMERSON, L.N.; RASHKA, K.E.;MURRAY, E.E. Transformation of cotton (G.hirsutum L.) by Agrobacterium tumefaciens andregeneration of transgenic plants. Plant MolecularBiology, v.10, p.105-116, 1987.GOULD, F. Sustainability of transgenic insecticidalcultivars: Integrating pest genetics and ecology.Annu. Rev. Entomol. , v. 43, p. 701-726, 1998.IKRAM-UL-HAQ; ZAFAR, U. Effect of netrates onembryo induction efficiency in cotton (Gossypiumhirsutum L.). African Journal of Biotechnology, v. 3,n. 6, p. 319-323, 2004.KUMRIA, R.; SUNNICHAN, V.G.; DAS, D. 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Indução de calos a partir de embriões zigóticos.Meio MIE0, Desenvolvimento de plântulas; (B) MeioMIE2, Calos + Plântulas e, (C) Meio MIE1, Calos.A BC4 Indução de Calos a partir de Embriões Zigóticos Imaturos em Duas Cultivares de Algodãoelite cotton cultivars via partcle bombardment ofmeristems. Biotechnology, v.11, p.596-598, 1993.MISHRA, R.; WANG, H.; YADAV, N.R. e WILKINS,T.A. Development of a high regenerable elite Acalacotton (Gossipium hirsutum cv. Maxxa) – a steptowards genotype-independent regeneration. PlantCell, Tissue and Organ Culture, v. 73, p. 21-35,2003.SAKHANOKHO, H.F.; ZIPF, A.; RAJASEKARAN, K.;SAHA, S.; SHARMA, G. e CHEE, P.W. Somaticembryo initiation and germination in diploid cotton(Gossypium arboreum L.). In Vitro Cell. Dev. Biol. –Plant, v. 40, p.177-181, 2004.SAS/STAT. User´s guide. In: SAS Institute SASONlindoc: Version 8.2, Cary, 2000. CD-RomSTELLY, D.M.; ALTMAN, D.W.; KOHEL, R. J.;RANGAN, T.S.; COMMISKEY, E. 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Highfrequency somatic embryogenesis and plantregeneration of an elite Chinese cotton variety. Bot.Bull. Acad. Sin., v. 42, p. 9-16, 2001.ComunicadoTécnico, 265Exemplares desta edição podem ser adquiridos na:Embrapa AlgodãoRua Osvaldo Cruz, 1143 Centenário, CP 17458107-720 Campina Grande, PBFone: (83) 3315 4300 Fax:  (83) 3315 4367e-mail: sac@cnpa.embrapa.br1a EdiçãoTiragem: 500Comitê dePublicaçõesPresidente: Luiz Paulo de CarvalhoSecretária Executiva: Nivia M.S. GomesMembros: Cristina Schetino BastosFábio Akiyoshi SuinagaFrancisco das Chagas Vidal NetoGilvan Barbosa FerreiraJosé Américo Bordini do AmaralJosé Wellington dos SantosNair Helena Arriel de CastroNelson Dias SuassunaExpedientes: Supervisor Editorial: Nivia M.S. GomesRevisão de Texto: Nisia Luciano LeãoTratamento das ilustrações: Geraldo F. de S. FilhoEditoração Eletrônica: Geraldo F. de S. Filho

Indução de calos a partir de embriões zigóticos imaturos em duas cultivares de algodão.

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