BEZERRA, C. de S.

HOFFMANN, L. V.

SUASSUNA, N. D.

VIDAL, M. S.

Infoteca-e

1Comparação entre Protocolos de Extração de DNA para  Ramularia areolaComunicadoTécnico240ISSN 0102-0099Junho/2005Campina Grande, PBComparação entre Protocolos deExtração de DNA para  Ramularia areolaMárcia Soares Vidal1Cíntia de Sousa Bezerra2Nelson Dias Suassuna3Lúcia Vieira Hoffman4A expansão agrícola, com o conseqüenteadensamento de populações de uma mesma espécievegetal contribui para maior disseminação dosagentes etiológicos de moléstias. Assim como asdemais culturas, o algodoeiro está sujeito ao ataquede microorganismos diversos, como bactérias, víruse fungos, alguns dos quais lhe causam doenças degrande expressão econômica. (LIMA et al, 1999).Nos últimos anos tem se verificado, principalmenteno Cerrado brasileiro, o aumento da severidade dealgumas doenças que antes eram consideradassecundárias, notadamente a mancha da ramulária ouramulariose a qual se tornou, em um curto espaçode tempo, a principal doença do algodoeiro nessaregião. Essa doença pode causar perdasconsideráveis à população, caso as medidas decontrole necessárias não sejam tomadas em tempohábil.A ramulariose, também conhecida como mancha daramulária, míldio areolar ou míldio cinza tem comoagente etiológico o fungo Ramularia areola. Opatógeno causa manchas de aparência irregular eangular, com 3-4mm de largura limitadas pelasnervuras. As manchas variam de verde claro aamarelo esverdeado na superfície superior da folha,na superfície inferior, variam de branco gelo aocinza, a folha torna-se clorótica e as lesões marromavermelhadas, ocorrendo então a desfoliação(WATKINS,1981). Na região do Cerrado ela ocorreprecocemente podendo causar a desfolha no“baixeiro” das plantas e danos econômicossignificativos aos produtores. A intensidade doprejuízo varia conforme a época de incidência dadoença e a variedade utilizada (SIQUERI,2001).As variedades de algodoeiro reagem diferentementeà Ramularia areola,   sendo provável a presença degenes de resistência a mancha da ramularia emalgumas cultivares de G. hirsutum e G. barbadense(RATHAIAH, 1976).A partir do desenvolvimento dos programas demelhoramento genético com base na análise dogenoma de organismos, dentre os quais destaca-se autilização de marcadores moleculares, que detectampolimorfismo ao nível de DNA, surgiu a possibilidadede analisar o genoma de R. areola e do algodoeirocom o objetivo de identificar cultivares tolerantes ou1 Bióloga, DSc., Embrapa Algodão, CP 174, CEP 58107-720, Campina Grande, PB. E-mail: mvidal@cnpa.embrapa.br2 Estagiária da Universidade Estadual da Paraíba, CEP 58109-753, Campina Grande, PB.3 Eng. Agr., MSc., Embrapa Algodão. E-mail: suassuna@cnpa.embrapa.br4 Eng. Agr., DSc., Embrapa Algodão. E-mail: hoff@cnpa.embrapa.br2 Comparação entre Protocolos de Extração de DNA para  Ramularia areolaresistentes à doença, sendo necessário estabelecerprotocolos de purificação de DNA ideais para cadaorganismo.Um dos problemas centrais encarado pelosmicrobiologistas que usam PCR é determinar ométodo mais eficiente – rápido e sensível – paraisolar pequenas quantidades de DNA a partir de umnúmero limitado de células (GRIFFIN et al., 2002).Vários protocolos tem sido testados para extrairDNA de fungo; entretanto, a maioria consome muitotempo ou requer grande quantidade de tecido.   Oobjetivo deste trabalho foi estabelecer a metodologiade extração de DNA de Ramularia areola. Osisolados foram obtidos a partir de folhas comsintomas da doença coletadas em diferentesmunicípios do estado de Goiás. O fungo foi cultivadoem placas de Petri, contendo meio V8, até atingiremo tamanho ideal para fazer uma extração de DNA.Para extração de DNA genômico foram testados osprotocolos sugeridos por Ferreira e Grattapaglia(1995), Goodwin  et al (1992) e Weising et al.(1995), sendo este último com três modificações.Os protocolos de Weising et al. (1995);  Ferreira eGrattapaglia (1995) e Goodwin et al (1992) forameficazes. Em todos constatou-se a presença de DNAsuficiente para realizar as reações de PCR. Como seprocurava um protocolo rápido e barato, o protocolode Ferreira e Grattapaglia (1995) não foi o idealquando comparado ao de Weising et al. (1995), umavez que se mostrou mais oneroso e consumindo maistempo, o que dificulta a análise de grande número deindivíduos.Entre as modificações testadas do protocolo deWeising et al. (1995), o mais adequado foi o número1, no qual a amostra foi macerada diretamente notampão de extração e a extração foi prosseguidasem realizar a etapa de gelo e degelo. O fato decongelar a amostra dificulta a maceração, e a etapade gelo e degelo demanda mais tempo, como todosos tratamentos foram eficientes na extração sugere-se o emprego deste por ser mais rápido e simplesque os demais. Adicionar 600 µL de tampão de extração preaquecido a 65°C (CTAB 2%; NaCl 1,4 M; EDTA 0,02 M; Tris-HCl  0,1 M pH 8,0; PVP-40 2%; β-mercapoetanol 10%) Coletar cerca de 300 mg de tecido em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL e  congelar imediatamente em N2 líquido Agitar os tubos por 30 segundos. Incubar os tubos a 65°C por 30 min., agitando-os a cada 5 min Adicionar 600 µL de clorofórmio:álcool isoamílico (24:1) e,  misturar lentamente por 5 min.  Centrifugar as amostras a 7.000 g, 4°C por 5 min Transferir a fase aquosa para novo tubo Adicionar 600 µL de isopropanol gelado e, misturar lentamente por inversão dos tubos Centrifugar as amostras a 7.000g, 4°C por 15 min e  descartar o sobrenadante Adicionar 300 µL de etanol 70% Centrifugar as amostras a 7.000 g e 4°C por 15 min e  descartar o sobrenadante Adicionar 300 µL de etanol 95% gelado Centrifugar as amostras a 7.000g e 4°C por 5 min e  descartar o sobrenadante Secar o precipitado a temperatura ambiente e  ressuspender em 100 µL de H2O Milli-Q® Esquema do protocolo 1 (FERREIRA e GRATTAPAGLIA,1995 modificado) Centrifugar por 15 minutos a 7.000g e 18ºC Transferir o sobrenadante para um novo tubo Adicionar o mesmo volume de isopropanol e incubar por 10 minutos a temperatura ambiente Centrifugar por 15 minutos a 7.000g e 18ºC  Adicionar 300 µL de etanol 70% Centrifugar as amostras a 7.000g e 4°C por 15 min e  descartar o sobrenadante Adicionar 300 µL de etanol 95% gelado Centrifugar as amostras a 7.000g e 4°C por 5 minutos e, descartar o sobrenadante Colocar o tecido em tubos de microcentrífuga de 1,5 ml  Adicionar 600µL de tampão de extração (Tris-HCL 200mM, NaCl 250 mM, EDTA 25 mM, SDS 0,5%)e vortexar por 30 segundos Macerar com o auxílio de pistilos de vidro até um pó fino Deixar em banho Maria por 10 minutos Adicionar 300µL de acetato de sódio 3M, misturar por inversão e incubar por 20 minutos a -20ºC Secar o precipitado a temperatura ambiente e ressuspender em 100 µL de H2O Milli-Q®  Esquema do protocolo 2 (Weinsing et al., 1995)3Comparação entre Protocolos de Extração de DNA para  Ramularia areola Centrifugar por 15 minutos a 7.000g e 18ºC Transferir o sobrenadante para um novo tubo Adicionar o mesmo volume de isopropanol e incubar por 10 minutos a temperatura ambiente Centrifugar por 15 minutos a 7.000g e 18ºC  Adicionar 300 µL de etanol 70%. Centrifugar as amostras a 7.000g e 4°C por 15 min e  descartar o sobrenadante Adicionar 300 µL de etanol 95% gelado Centrifugar as amostras a 7.000g e 4°C por 5 minutos e, descartar o sobrenadante Adicionar 600µL de tampão de extração e vortexar por 30 segundos Macerar com o auxílio de pistilos de vidro em presença de nitrogênio líquido até um pó fino Deixar em banho-maria por 10 minutos  Adicionar 300µL de acetato de sódio 3M, misturar por inversão e incubar por 20 minutos a -20ºC Secar o precipitado a temperatura ambiente e ressuspender em 100 µL de H2O Milli-Q®  Colocar o tecido em tubos de microcentrífuga de 1,5 ml e congelá-lo em nitrogênio líquido Esquema do protocolo 2, modificação 1 ( Weinsing etal., 1995) Centrifugar por 15 minutos a 7.000g e 18ºC Transferir o sobrenadante para um novo tubo Adicionar o mesmo volume de isopropanol e incubar por 10 minutos a temperatura ambiente Centrifugar por 15 minutos 7.000g e 18ºC  Adicionar 300 µL de etanol 70% Centrifugar as amostras a 7.000g e 4°C por 15 min e  descartar o sobrenadante Adicionar 300 µL de etanol 95% gelado Centrifugar as amostras a 7.000g e 4°C por 5 minutos e, descartar o sobrenadante Adicionar 600µL de tampão de extração e vortexar por 30 segundos Macerar com o auxílio de pistilos de vidro até um pó fino Transferir para nitrogênio líquido e em seguida para banho-maria 90-95ºC. Repetir 5 vezes  Deixar em banho-maria por 10 minutos adicionais Adicionar 300µL de acetato de sódio 3M, misturar por inversão e incubar por 20 minutos a -20ºC Secar o precipitado a temperatura ambiente e ressuspender em 100 µL de H2O Milli-Q®  Colocar o tecido em tubos de microcentrífuga de 1,5 ml  Esquema do protocolo 2, modificação 3 ( Weinsing etal., 1995) Centrifugar por 15 minutos a 7.000g e 18ºC Transferir o sobrenadante para um novo tubo Adicionar o mesmo volume de isopropanol e incubar por 10 minutos a temperatura ambiente Centrifugar por 15 minutos a 7.000g e 18ºC  Adicionar 300 µL de etanol 70% Centrifugar as amostras a 7.000g e 4°C por 15 min e  descartar o sobrenadante Adicionar 300 µL de etanol 95% gelado Centrifugar as amostras a 7.000g e 4°C por 5 minutos e, descartar o sobrenadante Adicionar 600µL de tampão de extração e vortexar por 30 segundos Macerar com o auxílio de pistilos de vidro em presença de nitrogênio líquido até um pó fino Transferir para nitrogênio líquido e em seguida para banho-maria 90-95ºC. Repetir 5 vezes  Deixar em banho-maria por 10 minutos adicionais Adicionar 300µL de acetato de sódio 3M, misturar por inversão e incubar por 20 minutos a -20ºC Secar o precipitado a temperatura ambiente e ressuspender em 100 µL de H2O Milli-Q® Colocar o tecido em tubos de microcentrífuga de 1,5 ml e congelá-lo em nitrogênio líquido Esquema do protocolo 3 (Goodwin et al., 1992) Adicionar 600 µL de tampão de extração pré-aquecido a 65°C (CTAB 2%; NaCl 1,4 M; EDTA 0,02 M; Tris-HCl  0,1 M pH 8,0; PVP-40 2%; β-mercapoetanol 10%) Coletar cerca de 300 mg de tecido em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL e,  congelar imediatamente em N2 líquido Agitar os tubos por 30 segundos Incubar os tubos a 65°C por 60 min., agitando-os a cada 5 min Adicionar 333µL de acetato de potássio, misturar e incubar no gelo por 20  minutos  Centrifugar as amostras a 7.000 g, 4°C por 10 min. Transferir a fase aquosa para novo tubo Adicionar 800 µL de isopropanol gelado e misturar lentamente por inversão dos tubos Centrifugar as amostras a 7.000g e 4°C por 10 min e  descartar o sobrenadante,  secar o precipitado e ressuspender em 500µL de TE Transferir fase aquosa para novo tubo e a esta adicionar 50 µL  de acetato de sódio e 1mL de etanol Incubar por 2 horas a -20ºC. Centrifugar por 10 minutos para descartar o sobrenadante Lavar o precipitado com 500µL de etanol 70% e depois com 300 µL de etanol 95% gelado Secar o precipitado a temperatura ambiente e  ressuspender em 100 µL de H2O Milli-Q® Incubar em gelo por 30 minutos Adicionar 500µL de fenol:clorofórmio;álcool isoamilico, agitar em vórtex. Centrifugar as amostras a 7.000g  e 4°C por 5 min Esquema do protocolo 2, modificação 2 ( Weinsing etal., 1995)4 Comparação entre Protocolos de Extração de DNA para  Ramularia areolaReferências BibliográficasFERREIRA, M. E. & GRATTAPAGLIA, D.; Introduçãoao uso de marcadores moleculares em análisegenética. 3ª ed. Brasília :Embrapa, 1998GOODWIN, S.B.; DRENTH, A.; FRY, W.E. Cloningand genetic analyses of two highly poly morfic,moderately repetitive nuclear DNA,s fromPhytophthora infestnas. Current Genetics, v. 22, p.107-105, 1992.GRIFFIN, D. W.; KELLOGG, C. A.; PEAK, K. K. &SHINN, E. A. A rapid and efficient assay forextracting DNA from fungi. Letters in AppliedMicrobiology, v34. P. 210-214, 2002LIMA, E. F.; BATISTA, F. A. S.; VIEIRA, R.M.Principais doenças do algodoeiro e seu controle inBELTRÃO, N. E. M. (org); O agronegócio do algodãono Brasil Brasília: Embrapa Comunicação paraTransferência de Tecnologia, 1999, v 2, p RATHAIAH, Y. Reaction of cotton species andcultivars to four isolates of Ramularia areola.Phytopatology v 66 1976. p 1007-1009SIQUERI, F. V.; ARAUJO, A. E. Controle químico deramularia (Ramularia areola) no algodoeiro(Gossypium hirsutum). In:CONGRESSO Brasileiro deAlgodão, 2001, Campo Grande. Anais... Dourados:Embrapa Algodão/Embrapa CPAO/UFMS, 2001.p.546-548.WATKINS, G. M. (ED) Compedium of cottondiseases. Aquila. The American PhytopathologicalSociety, 1981 p.WEISING, K.; NYBOM, H.; WOLF, K.; MEYER, W.DNA fingerprinting in plants and fungi. Boca Raton,CRC Press, 1995 322pComunicadoTécnico, 240Exemplares desta edição podem ser adquiridos na:Embrapa AlgodãoRua Osvaldo Cruz, 1143 Centenário, CP 17458107-720 Campina Grande, PBFone: (83) 3315 4300 Fax:  (83) 3315 4367e-mail: sac@cnpa.embrapa.br1a EdiçãoTiragem: 500Comitê dePublicaçõesPresidente: Luiz Paulo de CarvalhoSecretária Executiva: Nivia M.S. GomesMembros: Cristina Schetino BastosFábio Akiyoshi SuinagaFrancisco das Chagas Vidal NetoGilvan Barbosa FerreiraJosé Américo Bordini do AmaralJosé Wellington dos SantosNair Helena Arriel de CastroNelson Dias SuassunaExpedientes: Supervisor Editorial: Nivia M.S. GomesRevisão de Texto: Nisia Luciano LeãoTratamento das ilustrações: Geraldo F. de S. FilhoEditoração Eletrônica: Geraldo F. de S. Filho

Comparação entre protocolos de extração de DNA para Ramularia areola.

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