BRITO, J. Z. de

CARVALHO, J. M. F. C.

DONATO, V. M. T.

LIMA, M. M. de A.

MEDEIROS, M. J. L. e.

SANTOS, R. C. dos

SILVA, M. M. de A.

Portuguese

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1Procedimentos para indução de calos embriogênicos em algodãoISSN 0100-6460CircularTécnicaCampina Grande, PBSetembro, 2006103AutoresProcedimentos para indução de calos embriogênicos emalgodãoNa investigação dos diferentesníveis de variabilidade visandoà obtenção de genótiposmelhorados, a seleção deembrióides amplifica e otimizao trabalho de seleção.Por se tratar de umaferramenta importante nosprogramas de melhoramentogenético de algumas culturas,a produção de embriõessomáticos, mediante o cultivo de tecidos in vitro, é uma técnica deinteresse, já que permite a obtenção de embriões em grande escala,com elevada taxa de multiplicação e o rejuvenescimento do materialvegetal (SANTANA,1993).Segundo Zhang e Zhao (1997), citados por Zhang et al. (2000), técnicasin vitro podem prover meios de se obter ou induzir  variação somoclonalou, ainda, introduzir importantes genes, como genes para resistência apragas e doenças, através da engenharia genética. As técnicas daengenharia genética estão amplamente baseadas no cultivo de tecidos,pois a transformaçãorequer que se possa cultivar, in vitro, protoplastos,células e tecidos vegetais, que se vão transformar e cujas célulastransformadas possam regenerar plantas (GYVES, 1994).De acordo com Tuli e Kumar (2004),  os maiores  problemas para oêxito das aplicações da biotecnologia em algodão estão na dependênciado genótipo (GANESAN e JAYABALAN, 2005) e na baixa freqüência deembriogênese somática, resultando na dificuldade da regeneração detecidos transformados, razão por que, até o momento, a manipulação doalgodão através do cultivo de tecidos por meio da embriogênesesomática, se limita a poucos acessos de Gossypium hirsutum(DAVIDONIS e HAMILTON, 1983; TROLINDER e GOODIN,1987;TROLINDER e XHIXIAN, 1989), Gossypium klotzchianum (PRICE eSMITH, 1979)  e  G. barbadense (SAWAHEL, 2001).A eficiência da embriogênese somática em algodão também pode estarassociada a genes que codificam suas proteínas envolvidas em respostasinicial e fisiológica, bem como nos subseqüentes estádios dedesenvolvimento dos embriões somáticos (ZENG et al., 2006).Julita Maria Frota Chagas Carvalho Eng. Agrôn., Dr.  da EmbrapaAlgodão, Rua Osvaldo Cruz, 1143,Centenário, CEP 58107-720,Campina Grande, PB. E-mail:julita@cnpa.embrapa.br.Marleide Magalhães de Andrade LimaEng. Fl. Dr. da Embrapa algodão, E-mail: marleide@cnpa.embrapa.brRoseane Cavalcanti dos SantosEng. Agrôn., Dra. da EmbrapaAlgodão, E-mail:caval@cnpa.embrapa.brJúlio Zoé de BritoEng. Agrôn. Dr. IPA/CETENE,CP1022, CEP 50710-000, Recife, PEVirgínia Maria Tenório DonatoEng. Agrôn. Dr.  Bolsista IPA/UFAL,CP1022, CEP 50710-000, Recife, PEMarina Medeiros de Araújo SilvaUniversidade Estadual da Paraíba,Estagiárias da Embrapa Algodão,E-mail:marinamedeirosas@yahoo.com.brMaria Jaislanny Lacerda e MedeirosUniversidade Estadual da Paraíba,Estagiárias da Embrapa Algodão,E-mail:  jaislanny@yahoo.com.br2 Procedimentos para indução de calos embriogênicos em algodãoEntre as cultivares  de Gossypium hirsutum L., asmais utilizadas nos trabalhos de embriogênesesomática são as linhagens derivadas da  cv. Coker,devido a competência para regeneração, tal comoCoker 201 e Coker 312, que se têm tornadocultivares padrão em cultura de tecidos etransformação genética de algodão (RAO et al.,2006). Apesar de já existir um protocolo deregeneração descrito para a Coker, areprodutividade em nível laboratorial tem sidolimitada, fazendo-se necessários alguns ajustes paraestabelecimento de um protocolo de larga utilizaçãona área de cultivo de tecidos.Esta Circular Técnica apresenta metodologia deindução de calos embriogênicos em algodão, demodo a otimizar um protocolo efetivo que possa  serutilizado  nos programas de melhoramento genéticoe, conseqüentemente, no processo de obtenção deplantas de algodão transgênicas.Procedimentos para indução dos calosembriogênicosInicialmente, 300 sementes da cultivar Coker 312foram colocadas em tubos de ensaios (uma semente/tubo), contendo meio MS (MURASHIGE e SKOOG,1962), para germinação in vitro e servirem deplanta-matriz.  Para a indução dos calos sete diasapós a germinação, tomaram-se segmentos dehipocótilo os quais foram colocados em placas dePetri e aí cultivados por quatro semanas. O meiobásico de cultivo utilizado foi o MS -  30 g/L deglucose,  2,5 g/L de gelrite e 0,75 mg/L de MgCl2,suplementado com: 1) 0,1 mg/L de 2,4D (ácidodiclorofenoxiacético) + 0,5 mg/L de Cinetina -MS1; 2) 0,1 mg/L de ANA (Ácido naftalenoacético)+ 5,0 mg/L Cinetina - MS2, ambos ajustados para opH=5,8.Para proliferação dos calos após as quatro semanas,os explantes com os calos desenvolvidos foramtransferidos para os respectivos meios onde forammantidos durante mais quatro semanas.Decorrido  este período, os calos (na fase derediferencição) foram separados do explante inicial etransferidos para o meio contendo sais MS evitaminas do meio B5 (GAMBOR et al., 1968), naausência de fitorreguladores, com o dobro de nitratode potássio (1,9 g KNO3).Utilizaram-se, para cada tratamento, 15 repetiçõescom 12 explantes por placa.  Em todos os casos oscultivos foram mantidos a 30 ºC com umfotoperíodo de 16 horas de luz e intensidadeluminosa de 50 µmol/m2/s.Para constatação da rediferenciação dos tecidos eda formação de embrióides, retiraram-se amostrasde calos subcultivados na ausência defitorreguladores os quais foram analisados pormicroscopia eletrônica de varredura; para tanto, asamostras foram fixadas em tampão cacodilato desódio 0,2 M, contendo glutaraldeído (2,5%) eparaformaldeído (4%), durante 12 horas; após esteperíodo foram lavados três vezes em tampãocacodilato 0,1 M, durante 10 minutos por lavagem epós-fixados em  solução de tetróxiodo de ósmio(1%), em tampão cacodilato 0,2 M por 1 hora.Procederam-se a mais três lavagens em tampãocacodilato 0,1 M, durante 10 minutos e posteriordesidratação progressiva com etanol 10% a 100%de etanol, por 10 minutos cada uma; na últimalavagem as amostras permaneceram 1 hora emetanol 100%  antes de se realizar a secagem até oponto crítico. As amostras foram montadas emsuportes metálicos, cobertas com ouro por 180segundos, utilizando-se metalizador Fine Coat – íonSputter/JFC-1100 e observadas no microscópio devarredura (JEOL – JSM/5600LV/Scanning ElectronMicroscope).Tem-se, a seguir, o fluxograma de obtenção deembrióides (Figura 1).Obtiveram-se, através do protocolo MSsuplementado com 0,1 mg/L de 2,4D  + 0,5 mg/Lde Cinetina, calos de coloração amarelo-esverdeadoe  aspecto friável.Quando os calos obtidos não foram inoculados emmeio MS na ausência de fitorreguladores, observou-se que embrióides foram induzidos, sendoobservados a olho nu (Figura 2).3Procedimentos para indução de calos embriogênicos em algodãoFig. 1. Fluxograma das etapas da regeneração deplantas de algodão a partir de explante de hipocótilo, viaembriogênese simáticaFig. 2. Indução de calos embriogênicos (A) e deembrióides (B) da cultivar  Coker 312  em  meio  MS  naausência  de  fitorreguladores, a partir do  meiosuplementado com 2,4 D e Cinetina.No protocolo MS suplementado com 0,1 mg/L deANA + 5,0 mg/L Cinetina, não se constatou aformação de embrióides e os calos escureceram nossubcultivos sucessivos.A partir da análise dos tecidos processados pormicroscopia eletrônica de varredura (Figura 3), nasamostras dos calos provenientes do protocolo MSsuplementado com 0,1 mg/L de 2,4D  + 0,5 mg/Lde Cinetina e   subcultivados em meio MS (naausência de fitorreguladores), foi possível seconstatar a rediferenciação dos tecidos,confirmando a embriogênese somática.Coker 312  em  meio  MS  na  ausência  defitorreguladores, a partir do  meio suplementadocom 2,4 D e CinetinaReferências BibliográficasDAVIDONIS, G.H.; HAMILTON, R.H. Plantregeneration from callus tissue of (Gossypiumhirsutum L.) Plant Science Letters, v.32, p.89-93,1983.GANESAN, M.; JAYABALAN, N. Carbon sourcedependent somatic embryogenesis and plantregeneration cotton, Gossypiym hirsutum L. cv.SVPR2 through suspension cultures. Indian Journalof Experimental Biology, v.43, p.921-925, 2005Fig. 3. Rediferenciação dos tecidos e formação deembrióides, na ausência de fitorreguladores, analisadospor microscopia eletrônica de varredura.4 Procedimentos para indução de calos embriogênicos em algodãoGYVES, E.M. Agrobiotecnologia. México:Iberoamérica, 1994.78p.MURASHIGE, T.; SKOOG, F. A revised medium forrapid growth and bioassays with tobacco tissueculture. Physiologia Plantarum, v.15 p. 473-497,1962.PRICE, H.J.; SMITH, R.H. Somatic embryogenesis insuspension cultures of Gossypium klotzchianumAndress. Planta, v. 145,  p. 305-307, 1979.RAO, A.Q.; HUSSAIN, S.S.; SHAHZAD, M.S.;BOKHAIR,S.Y.A; RAZA,, M.H.; RAKHA,A.;MAJEED, A.; SHAHID, A.A.; SALEEM, Z.;HUSNAIN, T.; RIAZUDDIN, S. Somaticembryiogenesis in wild relatives of coton (Gossypiumspp.) Journal Zhejiang University, v.7, n.a4, p. 291-298, 2006.SANTANA, N. Embriogênese somática en el cultivodel cafeto (Coffeasp.).  1993. 230f. Tese(Graduação) – INCA.SAWAHEL, W.A. Stable genetic transformation ofcotton plant using polybrene-spermidine treatment.Plant Molecular Biology Reporter, v.19, p.377-377,2001.TROLINDER, N.L; GOODIN, J. R. Somaticembryogenesis and plant regeneration in cotton(Gossypium hirsutum L.). Plant Cell Reports, v.6,  p.231-234, 1987.TROLINDER, N.L; XHIXIAN, C. Genotype specificityof the somatic embryogenesis response in cotton.Plant Cell Reports, v.8,  p. 133-136, 1989.TULI, R.; KUMAR, M. Plant regeneration in cotton: ashort-term inositol starvation promotesdevelopmental syncrony in somatic embryogenesis.In Vitro Cellular and Development Biology – Plant.v.40, n.3, p.294-298, 2004ZENG, F.; ZHANG, X.; ZHU, L. TU, L.; GUO, X.; NIE,Y. Insolation and characterization of genesassociated to cotton somatic embryogenesis bysupression substractive hybridization andmacroarray. Plant Molecular Biology, v. 60, p.167-183, 2006.ZHANG, B.H; LIU, F.; YAO, C.B. Plant regenerationvia somatic embryogenesis in cotton.  Plant Cell,Tissue an Organ Culture, v.60, p.89-91, 2000CircularTécnica, 103Exemplares desta edição podem ser adquiridos na:Embrapa AlgodãoRua Osvaldo Cruz, 1143 Centenário, CP 17458107-720 Campina Grande, PBFone: (83) 3315 4300 Fax: (83) 3315 4367e-mail: sac@cnpa.embrapa.br1a EdiçãoTiragem: 500Comitê dePublicaçõesPresidente: Napoleão Esberard de Macêdo BeltrãoSecretária Executiva: Nivia M.S. GomesMembros:Cristina Schetino BastosFábio Akiyoshi SuinagaFrancisco das Chagas Vidal NetoJosé Américo Bordini do AmaralJosé Wellington dos SantosLuiz Paulo de CarvalhoNair Helena Castro ArrielNelson Dias SuassunaExpedientes: Supervisor Editorial: Nivia M.S. GomesRevisão de Texto: Nisia Luciano LeãoTratamento das ilustrações: Geraldo F. de S. FilhoEditoração Eletrônica: Geraldo F. de S. Filho

Procedimentos para indução de calos embriogênicos em algodão.

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Procedimentos para indução de calos embriogênicos em algodão.

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