COUTINHO, M. V.

MAGALHÃES, J. C. C.

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             PROCEDIMENTO DE OPERAÇÃO, MANUTENÇÃO E VERIFICAÇÃO DO ESPECTROFOTÔMETRO  Brasília, DF Dezembro 2007  Autor         José Cesamildo Cruz Magalhães Letras, B.Sc, Assistente, Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia  Marise Ventura Coutinho Engenheiro Agrônoma, M.Sc., Pesquisadora, Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia                 67 Circular Técnica     Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento  Código 038.11.04.10.4.004 Revisão 000 Cópia  Não-Controlada Página 2/11  Título: PROCEDIMENTO DE OPERAÇÃO, MANUTENÇÃO E VERIFICAÇÃO DO ESPECTROFOTÔMETRO   Data Nome Assinatura Elaboração 16/11/06 José Cesamildo Cruz Magalhães  Verificação 16/11/06 Marise Ventura Coutinho  Aprovação 16/11/06 Mauro Carneiro    SUMÁRIO  1 CAMPO DE APLICAÇÃO ........................................................................................................ 3 2 DEFINIÇÕES, SIGLAS E ABREVIATURAS. ........................................................................... 3 Definições ............................................................................................................................... 3 Siglas e abreviaturas ............................................................................................................. 3 3 RESPONSABILIDADES .......................................................................................................... 3 4 DESCRIÇÃO ............................................................................................................................ 4 Especificação do equipamento ............................................................................................. 4 Manutenção ............................................................................................................................ 6 Manutenção ............................................................................................................................ 7 Verificação/Calibração ........................................................................................................... 8 5 ANEXOS ................................................................................................................................ 10 6 REFERÊNCIAS ...................................................................................................................... 10 Complementares .................................................................................................................. 10       Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento  Código 038.11.04.10.4.004 Revisão 000 Cópia  Não-Controlada Página 3/11  Título: PROCEDIMENTO DE OPERAÇÃO, MANUTENÇÃO E VERIFICAÇÃO DO ESPECTROFOTÔMETRO   Data Nome Assinatura Elaboração 16/11/06 José Cesamildo Cruz Magalhães  Verificação 16/11/06 Marise Ventura Coutinho  Aprovação 16/11/06 Mauro Carneiro   OBJETIVO  É objetivo deste procedimento estabelecer critérios para operação, manutenção e verificação de espectrofotômetro.  1 CAMPO DE APLICAÇÃO  Este procedimento aplica-se à Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia.   Cruzadas  EMBRAPA RECURSOS GENÉTICOS E BIOTECNOLOGIA. Lista mestra de documentos do Sistema da Qualidade (038.10.02.00.6.001). Revisão 000. Brasília, 2006. 42 p.   2 DEFINIÇÕES, SIGLAS E ABREVIATURAS.  Definições  Este item não aplica-se ao documento.   Siglas e abreviaturas   DNA ácido desoxirribonucléico  STD standard (padrão)  3 RESPONSABILIDADES       Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento  Código 038.11.04.10.4.004 Revisão 000 Cópia  Não-Controlada Página 4/11  Título: PROCEDIMENTO DE OPERAÇÃO, MANUTENÇÃO E VERIFICAÇÃO DO ESPECTROFOTÔMETRO   Data Nome Assinatura Elaboração 16/11/06 José Cesamildo Cruz Magalhães  Verificação 16/11/06 Marise Ventura Coutinho  Aprovação 16/11/06 Mauro Carneiro   Pesquisadores, analistas, assistentes e colaboradores. 4 DESCRIÇÃO Especificação do equipamento  Fotômetro  a) sistema óptico: fotômetro monoespectral de absorção com feixe luminoso de referência e vários comprimentos de onda fixados;  b) fonte de luz: lâmpada de xenon;  c) comprimentos de onda: Xe (230; 260; 280; 320; 562; 595) nm;   d) seleção do comprimento de onda: dependente do método e controlada pelos programas;  e) largura da banda espetral: 5 nm: (230 até 320) nm; 7 nm: (562 até 595) nm;   f) faixa de medição fotométrica:   - cuvetas de quartzo:  0,000 até 3,000 A;  - Uvette® (Eppendorf): 2,5 A a 230 nm, 2,6 A a 260 nm, 2,8 A a 280 nm, 2,9 A a 320 nm.  g) inexatidão do comprimento de onda: ± 1 nm: (230 até 280) nm;  ± 2 nm: (320 até 595) nm;  h) inexatidão fotométrica: ±1% a 1 A;  i) imprecisão fotométrica: ≤ 0,002 A a 0 A; ≤ 0,005 A a 1 A;  j) exatidão de leitura: 0,001 A;     Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento  Código 038.11.04.10.4.004 Revisão 000 Cópia  Não-Controlada Página 5/11  Título: PROCEDIMENTO DE OPERAÇÃO, MANUTENÇÃO E VERIFICAÇÃO DO ESPECTROFOTÔMETRO   Data Nome Assinatura Elaboração 16/11/06 José Cesamildo Cruz Magalhães  Verificação 16/11/06 Marise Ventura Coutinho  Aprovação 16/11/06 Mauro Carneiro    k) detector de radiação: foto diodos de silício.  Procedimentos de medida  b) procedimento de medida: ponto final contra branco;  c) avaliação dependente do método:  - absorbância;  - concentração por meio de fator;  - concentração por meio de fórmula Warburg;  - concentração por calibração com 1 a 10 padrões;  - calibração a 1 ponto (1 padrão);  - regressão linear (2 a 10 padrões);  - regressão não linear (polinômio 3º grau: 4 ou 5 a 10  padrões) com 1, 2 ou 3 determinações;  - para ácidos nucléicos: quociente 260/280, quociente 260/230, concentração molar, rendimento total.     Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento  Código 038.11.04.10.4.004 Revisão 000 Cópia  Não-Controlada Página 6/11  Título: PROCEDIMENTO DE OPERAÇÃO, MANUTENÇÃO E VERIFICAÇÃO DO ESPECTROFOTÔMETRO   Manutenção   a) lubrificar o rotor na primeira corrida, engraxar a pista do rotor com algum lubrificante (spray de silicone ou óleo light), ou a cada 30 horas de uso ou no mínimo de 15 em 15 dias;  b) usar tubos e suportes apropriados ao rotor;  c) fechar a tampa da centrífuga até ouvir um clique, pois do contrário a mesma não começará a girar;  d) fechar a tampa da centrífuga refrigerada nos intervalos de uso, para evitar condensação;  e) se a centrifuga emitir algum som diferente, esta deve ser desligada imediatamente no botão STOP na parte frontal da centrífuga;  f) quando houver contaminação, após o uso, limpar com papel toalha, e jogar o papel contaminado no lixo biológico ou lixo químico. Usar pano úmido para limpeza diária;  g) após o uso, retirar o rotor, lavar as cavidades com escova plástica, água e detergente e enxaguar com água destilada e colocar invertido sobre papel-toalha para secar ao ar; h) chame um técnico caso a centrífuga comece a emitir ruídos desconhecidos e se a lâmpada brushes (escovas) acender. As escovas ficam gastas e devem ser trocadas periodicamente.  Memória  a) método de memória: 12 programas pré-programados, modificáveis;  b) memória de calibração: para todos os procedimentos de calibração;  c) memória de resultados: para 100 resultados, com valores de absorbância e razão, número da amostra, diluição, data e hora.      Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento  Código 038.11.04.10.4.004 Revisão 000 Cópia  Não-Controlada Página 7/11  Título: PROCEDIMENTO DE OPERAÇÃO, MANUTENÇÃO E VERIFICAÇÃO DO ESPECTROFOTÔMETRO   Dados gerais  a) tensão: (90 a 250) V; (45 a 65) Hz;   b) potência: aproximadamente 20 W em funcionamento, aproximadamente 10 W em “stand by”;   c) dimensões/peso: largura 20 cm; profundidade 32 cm; altura 10 cm, peso 3kg;   d) opção: termoimpressora 40 caracteres/linha; bomba de aspiração, para análises rápidas de proteínas e medição de turvações;  e) conexão para impressora: RS 232 C, serial.   Manutenção  a) desconectar o aparelho da tomada antes de iniciar a limpeza ou a troca de fusíveis;   b) limpar a parte externa do aparelho usando um pano levemente umedecido com uma solução de limpeza pouco concentrada;   c) para a desinfecção do aparelho, usar um pano umedecido com solução de etanol 70%; d) não deixar que nenhum líquido penetre no aparelho;  e) para limpar as cuvetas:  - usar somente uma haste com algodão umedecido com sabão neutro e água destilada;   - não usar álcool, nem qualquer substância corrosiva.  f) quando não estiverem em uso, as cuvetas devem ser tampadas e guardadas no estojo próprio para não entrarem em contato com poeira.       Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento  Código 038.11.04.10.4.004 Revisão 000 Cópia  Não-Controlada Página 8/11  Título: PROCEDIMENTO DE OPERAÇÃO, MANUTENÇÃO E VERIFICAÇÃO DO ESPECTROFOTÔMETRO   Verificação/Calibração  Este item não aplica-se ao documento.    Operação  a) ligar o espectrofotômetro usando o interruptor localizado atrás do aparelho;   b) o aparelho já vem com 12 métodos pré-programados de fábrica;  - cada método tem um programa que contém diferentes parâmetros, tais como unidade de concentração e tipo de cálculo;  - os programas podem ser mudados a qualquer tempo pressionando-se a tecla Parameter;  - antes de usar um método pela primeira vez, deve-se acessar o programa correspondente e, se for o caso, fazer as adequações necessárias.  Para o cálculo da concentração de proteínas usando um padrão (µg/mL)  a) selecionar o método proteína pressionando a tecla 4 Protein;  b) selecionar a calibração usando o padrão (STD), pressionando as teclas  ou ;  c) confirmar a seleção pressionando a tecla Enter (depois da confirmação, aparece no visor o bloco de seleção seguinte);  d) selecionar a unidade µg/mL pressionando as teclas  ou ;  e) confirmar pressionando a tecla Enter;       Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento  Código 038.11.04.10.4.004 Revisão 000 Cópia  Não-Controlada Página 9/11  Título: PROCEDIMENTO DE OPERAÇÃO, MANUTENÇÃO E VERIFICAÇÃO DO ESPECTROFOTÔMETRO   f) entrar com a concentração padrão (STD); escolher o comprimento de onda desejado pressionando a tecla 5 OD 600; pressionar duas vezes a tecla 0 Sample; confirmar pressionando a tecla Enter;  g) finalizar a configuração pressionando a tecla Parameter.  Para medir a concentração de DNA (fita dupla e simples), RNA e Oligonucleotídeos (µg/mL)  a) pressionar uma das teclas para selecionar o método escolhido:   - tecla 6 Oligo, para oligonucleotídeos;  - tecla 7 dsDN, para DNA fita dupla;  - tecla 8 ssDNA, para DNA fita simples;  - tecla 9 RNA, para RNA.  b) entrar com a cuveta contendo a solução para zerar a medição e pressionar a tecla Blank;  c) entrar com a cuveta contendo a amostra e pressionar a tecla Sample;   d) a diluição da amostra que está na cuveta pode ser medida pressionando a tecla  Dilution antes da medição começar. O valor da diluição será incluído automaticamente no cálculo do resultado;  e) como indicativo da pureza da amostra de ácido nucléico que foi medida, a absorbância de (230, 280 e 320) nm, as proporções A260/A280 e A260/A230, o resultado da concentração e a absorbância do comprimento de onda de 260 nm são mostradas no visor. No caso de amostras puras, a absorbância de 320 nm deve ser de aproximadamente zero;  f) se for necessária a conversão do resultado da medição, fazer os ajustes pressionando a tecla  Conversion; depois, pressionar Enter;   g) fazer a medição da próxima amostra pressionando Sample.     Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento  Código 038.11.04.10.4.004 Revisão 000 Cópia  Não-Controlada Página 10/11  Título: PROCEDIMENTO DE OPERAÇÃO, MANUTENÇÃO E VERIFICAÇÃO DO ESPECTROFOTÔMETRO   Procedimento para medições usando o método Bradford  a) selecionar o método Bradford pressionando a tecla 1 Bradford;  b) selecionar BRADFORD para medição de amostras de alta concentração ou BRAD.micro para amostras de baixa concentração;  c) entrar com  a cuveta com a solução para zerar a medição e pressionar Blank;   d) entrar com o primeiro padrão e pressionar Standard;  e) entrar com o último padrão e pressionar Standard;   f) se a amostra estiver diluída, fazer os ajustes pressionando a tecla  Dilution;  g) fazer a medição da amostra pressionando Sample.  5 ANEXOS  Este item não aplica-se ao documento.    6 REFERÊNCIAS Complementares EPPENDORF AG. BioFotômetro: manual de operação. Hamburgo, Alemanha, 2000, 139 p.            Diretório: SQ/Documentos Arquivo: 038.11.04.10.4.004 - Espectrofotômetro      Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento  Código 038.11.04.10.4.004 Revisão 000 Cópia  Não-Controlada Página 11/11  Título: PROCEDIMENTO DE OPERAÇÃO, MANUTENÇÃO E VERIFICAÇÃO DO ESPECTROFOTÔMETRO                         Circular  Técnica, 67     Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento Exemplares desta edição podem ser adquiridos na Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia Serviço de Atendimento ao Cidadão Parque Estação Biológica, Av. W/5 Norte (Final) – Brasília, DF CEP 70770-900 – Caixa Postal 02372 PABX: (61) 3448-4673 Fax: (61) 3340-3624 http://www.cenargen.embrapa.br e.mail:sac@cenargen.embrapa.br  1ª edição 1ª impressão (2007): Comitê de  Publicações           Expediente Presidente: Sergio Mauro Folle Secretário-Executivo: Maria da Graça Simões Pires Negrão Membros: Arthur da Silva Mariante  Maria da Graça S. P. Negrão   Maria de Fátima Batista   Maurício Machain Franco   Regina Maria Dechechi Carneiro   Sueli Correa Marques de Mello   Vera Tavares de Campos Carneiro Supervisor editorial: Maria da Graça S. P. Negrão Normalização Bibliográfica: Maria Iara Pereira Machado Editoração eletrônica: Daniele Alves Loiola   

Procedimento de operação, manutenção e verificação do Espectrofotômetro.

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Procedimento de operação, manutenção e verificação do Espectrofotômetro.

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