Potential\ua0effects\ua0of\ua0Rac1\ua0GTPase\ua0signalling\ua0in\ua0the\ua0deregulation\ua0of\ua0Alzheimer's\ua0Disease\ua0relevant\ua0proteins\ua0

Abstract

La malattia di Alzheimer (AD) rappresenta una patologia a carattere multifattoriale e la forma pi\uf9 diffusa di demenza. Nonostante sia stata descritta per la prima volta nel 1906, le cause della malattia sono ancora poco comprese. Negli ultimi anni diversi gruppi hanno descritto un possibile coinvolgimento delle small Rho GTPasi in AD (Bolognin et al., 2014). Tali proteine svolgono una molteplicit\ue0 di funzioni, tra cui una delle principali riguarda la regolazione delle dinamiche dell\u2019actina del citoscheletro (Hall e Lalli, 2010). Esse inoltre rivestono un ruolo importante nella morfologia delle spine dendritiche (Etienne\u2010Manneville e Hall, 2002), la cui alterazione \ue8 responsabile dei danni a livello sinaptico. Dal momento che la progressione dell\u2019AD \ue8 caratterizzata proprio da un\u2019estesa perdita di sinapsi, le alterazioni a livello del citoscheletro potrebbero essere la chiave di eventi patologici che contribuiscono alla sua insorgenza, e le Rho GTPasi potrebbero essere pertanto direttamente connesse alla malattia. Rac1, uno dei tre membri pi\uf9 studiati e meglio caratterizzati delle Rho GTPasi, \ue8 nota per avere un ruolo nella promozione della sopravvivenza neuronale (Le et al., 2005; Loucks et al., 2006). La stessa proteina inoltre si \ue8 vista essere deregolata in cervelli AD, suggerendo un suo possibile coinvolgimento nel processamento di beta amiloide (A\u3b2) dal suo precursore APP (Stankiewicz e Linseman, 2014). Partendo da queste premesse, lo scopo della tesi \ue8 stato quello di analizzare i pathways molecolari che connettono Rac1 e le proteine rilevanti della patologia AD, A\u3b2 e tau. Tutti gli esperimenti del lavoro di tesi sono stati eseguiti in vitro su neuroni corticali primari, andando a modulare le singole proteine. Il progetto \ue8 iniziato con il trattamento delle cellule attraverso somministrazione di A\u3b2 e induzione dell\u2019iperfosforilazione di tau. Entrambi gli approcci non hanno provocato effetti n\ue9 sulla localizzazione di Rac1 nelle cellule, n\ue9 sulla sua attivazione. Sono stati quindi effettuati alcuni esperimenti per manipolare l\u2019espressione e l\u2019attivit\ue0 di Rac1. Tale scopo \ue8 stato raggiunto attraverso l\u2019utilizzo di mutanti della proteina coniugati ad una sequenza TAT in grado di promuovere l\u2019internalizzazione della proteina stessa nelle cellule. Questo approccio ha dato come risultato una perturbazione nel metabolismo di A\u3b2 e promosso la traslocazione di SET, una proteina direttamente connessa all\u2019iperfosforilazione di tau. In particolare, solamente con l\u2019attivazione della proteina \ue8 stato possibile osservare un maggior livello di A\u3b2 o del suo precursore, mentre \ue8 bastata la sovra espressione di Rac1 a causare la traslocazione di SET dal nucleo alla membrana plasmatica. Considerati nel complesso, i dati illustrati descrivono un possibile pathway in cui Rac1 agisce a monte ed \ue8 in grado di influenzare la regolazione di proteine rilevanti in AD. Il coinvolgimento di Rac1 nel processamento di A\u3b2 non \ue8 un fatto completamente nuovo (Boo et al., 2008; Wang et al., 2009), tuttavia sembra che nessuno finora abbia approfondito quali siano i frammenti prodotti in seguito all\u2019attivazione di Rac1. Tale aspetto costituir\ue0 oggetto di futuri esperimenti. I dati riguardanti invece la traslocazione di SET dopo sovra espressione di Rac1 costituiscono un nuovo aspetto interessante che esperimenti futuri potranno meglio approfondire. Infatti, la diretta relazione tra Rac1 e SET \ue8 stata osservata solamente da due gruppi, ma non in cellule neuronali (ten Klooster et al., 2007; Switzer et al., 2011).Alzheimer\u2019s disease (AD) is a multifactorial pathology and the most common form of dementia in the elderly. Despite it was first described in 1906, the aetiology of AD is still poorly understood. Recently, different groups have highlighted the involvement of small Rho GTPases in AD (Bolognin et al., 2014), whose main function consists in the regulation of actin cytoskeleton dynamics (Hall and Lalli, 2010). Moreover, this family of protein plays an important role in dendritic spine morphology (Etienne\u2010Manneville and Hall, 2002), whose alterations are responsible for synaptic deficits. Since the progression of AD is characterized by a wide synaptic loss, alterations of cytoskeleton dynamics might be a key pathogenic event contributing to AD neuropathology, and Rho GTPases could be directly connected to the disease. Rac1, one of the three best characterized Rho GTPases, is known to act as neuronal survival promoter (Le et al., 2005; Loucks et al., 2006). Interestingly, it has been found that Rac1 is dysregulated in AD brain, suggesting a possible involvement in the processing of beta amyloid (A\u3b2) from its precursor APP (Stankiewicz and Linseman, 2014). Moving from these assumptions, the aim of this thesis was to investigate the molecular pathways connecting Rac1 and AD relevant proteins, A\u3b2 and tau. All the experiments were performed in vitro on primary cortical neurons, taking into account the modulation of the single proteins. The project has started with A\u3b2 administration and tau induced hyperphosphorylation, and both approaches did not result in any modification of Rac1 cellular distribution or activation. We proceeded then with the mis\u2010regulation of Rac1 activity, through the administration of mutant proteins fused with a TAT domain, which allows their internalization into the cells. This approach showed a perturbation of A\u3b2 metabolism, and elicited the translocation of SET, a protein directly connected to tau hyperphosphorylation. More in details, only Rac1 activation was able to enhance the levels of A\u3b2 or its precursor, while the over\u2010expression of the protein was sufficient to promote SET translocation from the nucleus to the plasma membrane. Taken together, the data describe a putative pathway in which Rac1 is up\u2010stream and it is able to affect the regulation of AD relevant proteins. The involvement of Rac1 in the processing of A\u3b2 is not completely new (Boo et al., 2008; Wang et al., 2009), but, to our knowledge, nobody has already investigated which fragments can be produced after Rac1 activation. On the other hand, the data on SET translocation after Rac1 over\u2010expression constitute a new insight and future experiments could be better clarify this direct connection between SET and Rac1 in AD context. Indeed, only two groups found the same pathway, but not in a neuronal population (ten Klooster et al., 2007; Switzer et al., 2011)