OLIGODENDROCYTES FROM SPINAL CORD MENINGES: AMPLIFICATION, CHARACTERIZATION AND TRANSPLANTATION IN CONTUSIVE INJURY

Abstract

Nonostante le lesioni traumatiche del midollo spinale siano abbastanza frequenti e comportino una grave sofferenza per l\u2019individuo (sia livello fisico che psicologico) e pesanti costi di assistenza diretta ed indiretta, per questa patologia la terapia \ue8 ancora limitata ad interventi di minimizzazione del danno in fase acuta e di supporto e sostegno fisico nella fase cronica. Lo sviluppo della medicina rigenerativa ha ovviamente prodotto una grande aspettativa in questo settore; la scoperta della presenza di cellule neurali staminali nel sistema nervoso centrale dell\u2019adulto e l\u2019ampliarsi della conoscenza dei meccanismi che ne regolano il destino hanno infatti fatto intravedere la possibilit\ue0 di applicazioni terapeutiche di queste cellule nel danno al midollo spinale. Di conseguenza, un buon numero di trials clinici basati sul trapianto di cellule staminali di diversa origine \ue8 stato attivato anche se, al momento, non \ue8 ancora emersa una soluzione definitiva. La maggior parte dei trapianti sperimentati \ue8 stata condotta sinora con cellule staminali non neurali in quanto queste sono di facile reperimento anche da individui adulti; per quanto infatti le cellule staminali neurali siano efficientemente prelevabili da blastocisti e da embrioni, nell'adulto le uniche fonti consistenti sono rappresentate solo da alcune nicchie localizzate in vicinanza dell'ippocampo e dei ventricoli, quindi in zone di difficile accesso per un prelievo autologo o in donatore vivente. Il nostro gruppo ha recentemente dimostrato che le leptomeningi ospitano una popolazione di cellule con propriet\ue0 staminali neurali presenti nel roditore anche in et\ue0 adulta. Queste cellule possono essere coltivate ed espanse in vitro come neurosfere e possono essere indotte a differenziare in neuroni ed oligodendrociti. Se trapiantate in area ippocampale o ventricolare, queste cellule si integrano con il tessuto normale, entrando apparentemente a far parte dell'esistente rete neuronale. Inoltre, a seguito di danno traumatico del midollo spinale, le cellule delle leptomeningi si attivano e migrano all\u2019interno del parenchima, dove partecipano alla reazione al trauma. Considerata la facile accessibilit\ue0 chirurgica delle meningi e la loro presenza in et\ue0 adulta, le cellule staminali delle leptomeningi (LeSCs) rappresentano un potenziale candidato per la terapia rigenerativa del danno al midollo spinale; altrettanto importante \ue8 l'osservazione che le LeSCs possono essere isolate anche da biopsie di meningi umane prelevate nel corso di interventi neurochirurgici (asportazione di tumori). Questo progetto di tesi indaga in profondit\ue0 la possibile applicazione di LeSCs per terapie rigenerative di traumi del midollo spinale; considerato il fatto che i fenomeni di demielinizzazione post-traumatica giocano un ruolo fondamentale nella patogenesi del danno al midollo spinale e che studi condotti con cellule di diversa origine hanno dimostrato come un approccio di medicina rigenerativa basato sulla stimolazione dei processi di rimielinizzazione possa portare a risultati promettenti, nel mio lavoro ho innanzitutto sviluppato ed ottimizzato un metodo in grado di amplificare le LeSCs in vitro e di differenziarle efficacemente in oligodendrociti. \uc9 stato quindi messo a punto un protocollo innovativo di crescita e differenziamento delle LeSCs e, mediante l\u2019analisi dell\u2019espressione proteica e genica, \ue8 stato analizzato e dimostrato come queste cellule acquisiscano sia la tipica morfologia degli oligodendrociti, sia un\u2019elevata espressione di diversi geni mielina-specifici. Il potenziale rigenerativo degli oligodendrociti derivati dalle LeSCs \ue8 stato quindi verificato in vivo in un modello animale di danno contusivo al midollo spinale. Nelle nostre condizioni sperimentali il trapianto degli oligodendrociti \ue8 associato ad un significativo aumento del recupero di alcune funzioni motorie, come determinato dalla valutazione con BBB score e analisi CatWalk. In conclusione, questo lavoro suggerisce per la prima volta che le cellule staminali delle leptomeningi possono rappresentare una risorsa nella terapia cellulare del danno del midollo spinale e apre la strada per futuri studi di medicina rigenerativa applicabili all\u2019uomo.Spinal cord injury (SCI) is a single event with devastating effects on the life of patients both in physiological and psychological terms and for which only supportive and damage-limiting interventions are available at the moment. In the last decades, regenerative therapies based on cell transplantation have generated increasing attention as a potential therapeutic approach for degenerative diseases such as spinal cord injury. In addition, the discovery of neural stem cells in the adult central nervous system and the expansion of the knowledge of the mechanisms regulating their fate have increased the expectations for therapeutic application of these cells to spinal cord injury. Indeed, a considerable number of potential cell-based regenerative therapies have reached the stage of clinical trial, but a clear solution has not emerged yet. We have recently shown that the leptomeninges host a cell population with neural stem/progenitor properties both in vitro and in vivo: isolated leptomeningeal cells can be propagated in vitro as neurospheres and induced to differentiate into neurons and oligodendrocytes. Moreover, they have been shown to become activated by injury to both the brain and the spinal cord and to migrate in the parenchyma, where they participate in the reaction to the injury. Considering the easily accessible anatomical location of the meninges, leptomeningeal stem/progenitor cells (LeSCs) represent a potential candidate for regenerative cell therapy for spinal cord injury. With this work, we provide a first evidence that leptomeningeal cells might indeed play a role in regenerative therapies applied to SCI. Considering the pathogenetic role of demyelination in SCI and that remyelination is a promising therapeutic approach, we first developed and optimized a method for efficient in vitro production of LeSCs and differentiation into mature oligodendrocytes; protein and gene expression analysis showed that by the end of the protocol cultured LeSCs acquired both the typical morphology of mature oligodendrocytes and the elevated expression of different myelin-specific genes. In addition, we performed a pilot study of the regenerative potential of LeSCs-derived oligodendrocyte precursors in an animal model of contusive spinal cord injury. In our conditions, cells transplantation was associated with a significant improvement of some of the motor functions, as determined by behavioural evaluation through BBB score and CatWalk gait analysis. This work indicates for the first time that leptomeningeal stem/progenitor cells could represent an asset in both transplantational and pharmacological therapy for spinal cord injury and paves the way to further studies of regenerative medicine in human SCI