Induzione del differenziamento osteoblastico in cellule di osteosarcoma umano MG63 mediante acido ascorbico

Abstract

L\u2019acido ascorbico (AsA) \ue8 un importante co-fattore nell\u2019idrossilazione dei residui di prolina e lisina del collagene ed \ue8 necessario per il differenziamento di numerosi tipi cellulari, tra cui gli osteoblasti. Le MG-63 sono una linea cellulare di osteosarcoma (OSC) utilizzate per lo studio del differenziamento osteoblastico. Esse sono osteoblasti atipici esprimendo bassi livelli di alcuni fattori di trascrizione (Runx-2, Bone morphogenetic protein 2-Bmp-2) e proteine (fosfatasi alcalina-ALP, osteocalcina-OC, collagene tipo I-Col1A1) osteoblasto-specifiche e possedendo una bassa capacit\ue0 di ossificazione. Alcuni studi indicano che AsA aumenta l\u2019attivit\ue0 dell\u2019ALP nelle OSC, ma il suo ruolo nel differenziamento cellulare non \ue8 ancora chiaro. Lo scopo del nostro lavoro \ue8 di studiare il suo effetto sulle MG-63. Le cellule sono state trattate con diverse concentrazioni di AsA (0, 63, 125, 250 mcM). Dopo 4 giorni abbiamo eseguito lo studio della proliferazione cellulare (XTT), dell\u2019espressione genica (RT-PCR) e proteica (immunoblotting) e di immunocitochimica. L\u2019Alizarin red assay, che rileva i nuclei di calcificazione, \ue8 stato eseguito dopo 6 giorni, la valutazione dell\u2019ALP ogni 2 giorni per 10 giorni. I nostri dati hanno evidenziato, nelle cellule trattate, una lieve riduzione della proliferazione cellulare. Contemporaneamente l\u2019analisi dell\u2019espressione genica ha rilevato, nelle cellule trattate, un incremento di Runx-2 ed Ostepontina, nessuna variazione dell\u2019Osteonectina, una riduzione di Col1A1. Il dato \ue8 stato confermato sia attraverso l\u2019immunocitochimica, con l\u2019incremento della percentuale di cellule positive per Runx-2, Bmp-2 ed Osteocalcina, sia attraverso immunoblotting con l\u2019aumento delle Bmp-2. La valutazione citochimica dell\u2019ALP ha evidenziato un progressivo incremento della colorazione per l\u2019ALP con l\u2019aumentare dei giorni di esposizione al farmaco, mentre l\u2019Alizarin red assay ha confermato la presenza di nuclei di ossificazione nelle cellule trattate. I nostri dati mostrano per la prima volta l\u2019induzione, mediata dall\u2019AsA, di fattori di trascrizione precoci osteoblasto-specifici nelle OSC, contribuendo a chiarire quale possa essere l\u2019effetto dell\u2019AsA nel corso del differenziamento osteoblastico. Inoltre, fornisce importanti indicazioni sul comportamento delle OSC, rivelando come il blocco dell\u2019espressione di fattori di trascrizione sia un co-fattore nella tumorogenenesi e nel mantenimento di un basso grado di differenziamento. Infine, il condizionamento delle MG-63 mediante acido ascorbico permette di ricreare un modello cellulare pi\uf9 osteoblasto-simile rispetto alla linea cellulare originale.Ascorbic acid (AsA) is an important co-factor for the hydroxylation of proline and lysine residues in collagen and it is necessary for the differentiation of many cellular types, included osteoblasts. MG-63 is an osteoblast-like osteosarcoma lineage (OSC) often used for the study of osteoblast differentiation, but it is an atypical model since a low expression of some osteoblast specific transcription factors (Runx-2, Bone morphogenetic protein-Bmp-2) and proteins (bone alkaline phosphatase-BALP, osteocalcin-OC, type I collagen-Col1A1) and a low calcium deposition capability are observed. Some studies indicates that AsA increases BALP activity in OSC but its role in the differentiation process is not completely clear. The aim of our work is to study the effect of AsA in MG-63. Cells were treated with different AsA concentration (0,63, 125, 250 mcM) for 4 days. Then, we performed a proliferation assay (XTT), gene expression (RT-PCR) and protein (immunoblotting) analysis and immunocytochemistry evaluation. Alizaryn red assay for calcium deposition was performed after 6 days, and BALP colorimetric assessment every 2 days for 10 days. Our results showed a slight reduction of cell proliferation. At the same time, we observed an increased gene expression of Runx-2 and Osteopontin, no variation of Osteonectin, a reduction of Col1A1. These results were confirmed by the increased percentage of positive cells for Runx-2, Bmp2 and OC in immunocytochemistry, and by the increased Bmp-2 expression in immunoblotting analysis. The number of BALP positive cells increased progressively according with the duration of the treatment and Alizaryn red assay confirmed calcium deposition after therapy. These data, for the first time, show that AsA increases early osteoblastic specific transcription factors in OSC and they contribute to clarify a possible mechanism used by AsA to induce osteoblast differentiation. They give us also important information about OSC, in particular they confirm the crucial role of some transcription factors in tumorogenesis and in differentiation process. Finally, we could suggest that MG-63 are more osteoblast-like then original lineage after AsA treatment