Ogni azione effettuata dal sistema nervoso come la percezione dei segnali sensoriali
il controllo motorio, le funzioni cognitive come l\u2019apprendimento e la memoria,
dipende da precise connessioni a livello dei neuroni. Queste specifiche connessioni
sono realizzate durante la fase di sviluppo embrionale e post-natale.
Lo studio dei meccanismi che sono alla base della formazione dei complessi circuiti
neuronali ha da sempre affascinato ed interessato un ampio numero di scienziati.
Negli ultimi decenni, gli avanzamenti delle tecniche di microscopia e di biologia
molecolare hanno contribuito ad aumentare le nostre conoscenze sui principali
meccanismi alla base della formazione delle sinapsi e sulle molecole responsabili
della specificit\ue0 delle connessioni sinaptiche.
Nonostante l\u2019enorme progresso delle nostre conoscenze nel campo restano ancora
molti quesiti senza risposta, come ad esempio, non sono ancora noti i meccanismi che
determinano il tipo di neurotrasmettitore nei neuroni. E\u2019 noto che la giunzione
neuromuscolare di mammifero utilizza come neurotrasmettitore l\u2019acetilcolina, ma
recentemente, \ue8 stato osservato che in particolari condizioni neuroni glutammatergici
di mammifero sono in grado di formare sinapsi funzionali con fibre muscolari. Infatti
in uno studio eseguito su ratto da un gruppo di ricercatori dell\u2019Universit\ue0 di Brescia,
\ue8 stato osservato che, con l\u2019innesto di un nervo periferico tra il midollo spinale e un
muscolo addominale, \ue8 possibile sostituire la sinapsi colinergica della giunzione
neuromuscolare, con una nuova connessione glutammatergica proveniente da neuroni
sopraspinali. Inoltre, \ue8 stato osservato che i mioblasti dello Xenopus durante lo
sviluppo esprimono una grande variet\ue0 di recettori per vari tipi di neurotrasmettitori e
che a seconda del fenotipo neurotrasmettitoriale, espresso dal terminale presinaptico,
le cellule muscolari mantengono l\u2019appropriato recettore, suggerendo cos\uec, che la
scelta del tipo di recettore dipende dal neurotrasmettitore liberato.
Lo scopo della mia tesi \ue8 quello di approfondire i meccanismi alla base della
formazione delle insolite sinapsi glutammatergiche muscolari nel mammifero.
Nella prima parte del lavoro ho cercato di studiare mediante tecniche di
elettrofisiologia intracellulare le sinapsi glutammatergiche muscolari che si formano
in vivo tra vie discendenti e fibre muscolari nel ratto. Da questa prima parte non ho
ottenuto delle registrazioni intracellulari in quanto gli animali operati hanno
presentato tutti innervazione di tipo colinergico. Nella seconda parte del lavoro ho
caratterizzato, con tecniche morfologiche, elettrofisiologiche e di biologia molecolare
la formazione in vitro di sinapsi glutammatergica tra neuroni corticali e cellule di
muscolo scheletrico di mammifero. Studi di immunofluorescenza hanno evidenziato
la presenza di recettori AMPA (AMPAR) su cellule muscolari in cocoltura con
neuroni corticali. In colture di soli miotubi il AMPAR non \ue8 espresso. In studi di
imaging del calcio ho osservato che in seguito a stimolazione dei neuriti che
contattano i miotubi si ha un incremento della concentrazione di calcio intracellulare.
La stimolazione dei neuriti ha indotto contrazione dei miotubi. La somministrazione
del curaro, un antagonista dei recettori colinergici, non ha modificato la contrazione
della cellula muscolare, mentre la somministrazione di un antagonista dei recettori
per il glutammato ha immediatamente bloccato la contrazione dei miotubi. Infine
studi di immunoprecipitazione ed immunoblotting eseguiti su cocolture di neuroni
corticali e cellule muscolari hanno dimostrato che il recettore del glutammato di tipo
AMPA \ue8 espresso solamente dalle cellule muscolari in cocoltura e che l\u2019espressione
del recettore \ue8 accompagnata dalla presenza di proteine che solitamente costituiscono
la struttura postsinaptica di sinapsi centrali. Quindi i risultati del mio lavoro hanno
dimostrato, per la prima volta, che \ue8 possibile indurre la formazione in vitro di una
sinapsi glutammatergica nelle fibre muscolari di mammifero.Each of the behavioral tasks performed by the nervous system, from the perception of
sensory input and the control of motor output to cognitive functions such as learning and
memory, depends on precise interconnections of many millions of neurons. These
connections are developed during embryonic and post natal development. The study of
the mechanisms that underlie synaptic formation has always interested a great number of
scientists.
In the last ten years, microscopy and molecular biology techniques have supplied a great
number of knowledges about the mechanisms of synaptic formation. Despite the amount
of information about synaptogenesis there are still many unknown processes behind the
development of a synapse, such as the mechanisms that induce the correct expression of
neurotransmitters (and their receptors). It is well known that acetylcholine is the only
neurotransmitter in mammalian neuromuscular junction, but recently it has been
demonstrated that glutamatergic neurons are able to form functional synapses with
mammalian muscle under particular conditions. At the University of Brescia it has been
observed that a new glutamatergic innervation of skeletal muscle replaces the original
cholinergic one when the transversus abdominal muscle is denervated and a distal nerve
stump is inserted in the white lateral matter of spinal cord in rat. Moreover, Xenopus
muscle cells express several classes of transmitter receptors in addition to those for
acetylcholine in early embryonic development. During normal differentiation and
innervation of muscle, the other classes of receptors disappear. Changing the expression
of transmitters by altering calcium spike activity leads to retention of the classes of
cognate, noncholinergic receptors. This indicates that the expression of appropriate
receptors is due to the neurotransmitter
The aim of this work was to study the mechanisms that underlie the formation of
glutamatergic muscular synapses observed at the University of Brescia. Muscles, to which
descending glutamatergic fibres had been diverted from the spinal cord by means of a
peripheral nerve graft, were studied by intracellular electrophysiological techniques in the
first part of the project. Surgical procedures were performed at Brescia University.
Unfortunately, all analyzed muscles showed cholinergic innervation.
In the second part of the project, murine co-cultures with cortical neurons and skeletal
muscle cells were developed. Electrophysiological, biochemical and morphological
analysis showed that, under these conditions, cortical neurons develop functional
glutamatergic synapses with muscle cells. Immunofluorescence studies also have
demonstrated the presence of AMPA receptors (AMPARs) on muscular cells in the cocultures.
Calcium imaging studies showed that electrical stimulation of cortical neurites,
reaching myotubes, induced an increase of intracellular calcium concentration in the
muscular cells. Electrical stimulation of neurites also produced contraction of myotubes.
The contractions were resistant to curare, a common blocker of acetylcholine receptors,
but they were sensitive to the glutamate AMPAR antagonist (GYKI 52466). Finally, coimmunoprecipitation
and immunoblotting analysis demonstrated that only myotubes cocultured
with cortical neurons express AMPARs and moreover it was seen that muscle
cells express proteins of central post synaptic density (PSD).
These data show, for the first time, that it is possible to induce the formation of a
glutamatergic synapse on mammalian muscle cell in vitro