Queratinase da bactéria termófila Anoxybacillus sp. PC2 : produção, purificação parcial e caracterização

Abstract

Queratinases são proteases de especial interesse devido a sua ação sobre a queratina insolúvel, que por sua vez, é o principal componente das penas. As penas de aves são fonte de aminoácidos, e, portanto, são transformadas em farinha de pena e utilizadas em ração animal. Entretanto, este produto possui baixo valor nutricional devido a sua baixa digestibilidade, já que a queratina não é degradada por enzimas proteolíticas comuns. Nesse contexto, as queratinases microbianas são uma abordagem promissora para conversão de queratina em hidrolisados proteicos. Os objetivos deste trabalho foram selecionar e identificar bactérias termófilas provenientes do bioma Caatinga (Brasil) capazes de produzir queratinases termoativas, e caracterizar a queratinase produzida pelo isolado selecionado. Oito bactérias proteolíticas foram isoladas de uma amostra de solo. Destas, o Anoxybacillus sp. PC2 produziu queratinase com maior atividade em meio composto por penas (2%), KH2PO4 (0,04%), K2HPO4 (0,2%) e NaCl (0.05%) em pH 6,5 e 60 ºC. A protease queratinolítica foi parcialmente purificada por concentração em dispositivo de filtração (10.000 NMWL) e cromatografia de troca aniônica. A protease parcialmente purificada foi ativa em uma faixa de pH de 5 a 10, com alta atividade entre as temperaturas de 50 e 80 ºC. A atividade ótima foi observada em pH 7 e entre 50 e 60 ºC, tornando-a adequada para utilização em processos biotecnológicos para bioconversão de queratina. Um estudo molecular conduzido para identificar a provável protease queratinolítica produzida pelo Anoxybacillus sp. PC2 identificou uma metaloprotease neutra, cujo gene apresentou 98% de similaridade com o gene nprS de Geobacillus stearothermophilus.Keratinases are proteases of special interest due to their action on insoluble keratin, which in turn, is the major component of feathers. The poultry feathers are a source of amino acids, and therefore, are converted to feather meal to be used as animal feedstuff. However, this product has low nutritional value due to its poor digestibility, since keratin is not degraded by common proteolytic enzymes. In this context, microbial keratinases are a promising approach to convert keratin into protein hydrolysates. The aims of this study were to select and identify thermophilic bacteria from Caatinga biome (Brazil) capable to produce thermoactive keratinases, and characterize the keratinase produced by the selected isolate. Eight proteolytic bacteria were isolated from a soil sample. Of these, Anoxybacillus sp. PC2 produced keratinase with higher activity in a medium composed of 2% feather waste, 0.04% KH2PO4, 0.2% K2HPO4 and 0.05% NaCl at pH 6.5 incubated at 60 ºC. The keratinolytic protease was partially purified by concentration in a centrifugal filter device (10,000 NMWL) and anion-exchange chromatography. The partially purified protease was active in a pH range of 5.0-10.0 with high activity in temperature range of 50-80 ºC. The optimum activity was observed at pH 7.0 and 50-60 ºC, making it suitable for biotechnological processes for keratin bioconversion. A molecular study conducted to identify the presumable keratinolytic protease produced by Anoxybacillus sp. PC2 identified a neutral metalloprotease whose gene showed 98% similarity with Geobacillus stearothermophilus nprS gene