Guerra, Adriele Scopel

Lume 5.8

Urease de Helicobacter pylori e sua interação com receptores de membranas plaquetáriasScopel-Guerra A.1, Uberti, A.F.1, Olivera-Severo, D.3, Carlini, C.R.1,21 Programa de Pós graduação em Biologia Molecular e Celular, Centro de Biotecnologia; 2 Departamento de Biofísica, UFRGS, Porto Alegre, Brasil;3 Instituto de Medicina Molecular de Veneza, Pádua, Itália.Ureases (EC 3.5.1.5) são enzimas níquel-dependentes que catalisam ahidrólise da uréia em amônia e dióxido de carbono. Ureases bacterianas sãocompostas de multímeros de duas ou três subunidades. As similaridadesentre as ureases de bactérias e plantas sugere que elas descendem de ummesmo ancestral. Têm mesma estrutura terciária e mecanismo catalíticosemelhante. Helicobacter pylori é uma bactéria Gram negativa que parasitao epitélio gástrico humano, e é considerada um fator de risco associado aúlceras gástricas e duodenais por mecanismos que ainda não são bemcompreendidos. Estudos mostram, ainda, uma correlação entre a infecçãocom H. pylori e doenças cardiovasculares. A urease produzida por H. pylori(HPU) é considerada um fator de virulência, pois sua atividade ureolíticaaumenta o pH do meio possibilitando a colonização do epitélio gástrico.Nosso grupo mostrou que HPU induz agregação plaquetária de maneiraindependente da atividade ureolítica, induzindo a secreção de ADPplaquetária pela via de lipoxigenase. Essa urease ainda induz edema de pataem camundongos envolvendo metabólitos da via do ácido araquidônico.Outros resultados sugerem que a HPU recruta a mesma cascata desinalização utilizada pelo colágeno na agregação plaquetária incluindo aativação da 12-lipoxigenase ligando-se ao receptor de colágeno.1. Introdução840 aaCanavalia ensiformis238/569 aaHelicobacter pylori47% 52%100/126/569 aaBacillus pasteurii52% 41% 59%100/101/567 aaKlebsiella aerogenes60% 53% 54%Proteus mirabilis58% 51% 53%100/109/567 aaGlycine max (Embrião) 838 aa81%Glycine max (Ubiqua) 837aa75%Figura 1. Estrutura da urease de Helicobacter pylori: Ureases vegetais como as deCanavalia ensiformis tem uma única subunidade enquanto as bacterianas têm duas(Helicobacter pylori) ou três (Klebsiella aerogenes) subunidades. O número de resíduosde aminoácidos de cada subunidade está indicado. O percentual de identidade dofragmento de C. ensiformis é mostrado sob proteínas bacterianas.Figura 2. Agregação de plaquetas de coelhoinduzidas por urease recombinante deHelicobacter pylori (HPU): Plasma de coelhorico em plaquetas em placas multiwell foiexposto a concentrações crescentes de HPU ou5 μM ADP (100% agregação). Resultadosexpressos como porcentagem de agregaçãomáxima para 4 replicatas.0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25050100M% AggregationAggregation %2. ObjetivosNeste trabalho investigamos: a relevância do ADP na agregação induzida por HPU; a redundância das cascatas ativadas por HPU e colágeno em plaquetas; a participação do receptor plaquetário de colágeno (GPVI) comomediador das respostas induzidas por HPU nas plaquetas.3. Material e Métodos HPU recombinante produzida em E. coli purificado através de duascromatografias de troca iônica e uma gel filtração; A agregação plaquetária foi monitorada a cada 11 seg durante 20minutos em um leitor de placas SpectraMax e monitorada por 8 minem um agregômetro; Para os experimentos usamos apirase de batata (seqüestrador deADP), luciferina-luciferase (emite luz na presença de ATP), ADP(indutor de agregação) e colágeno tipo III (indutor de agregação) daSigma Chem. Co.; E anticorpos anti-GPVI (reconhece o receptor na membrana daplaqueta) da Santa Cruz.4. ResultadosFigura 4. Envolvimento do GPVI na agregação plaquetária induzida por HPU:Agregação plaquetária induzida por HPU (300 nM) ou 20 ug/mL colágeno écompletamente abolida na presença do anticorpo anti-GPVI. As plaquetas foram pré-incubadas com anti-GPVI (500 g/mL) por 10 min em temperatura ambiente semagitação; depois a agregação foi induzida pela adição de HPU ou colágeno (tempozero) e foi monitorada turbidimetricamente por 8 min.Nossos resultados mostram que: agregação plaquetária induzida por HPU é dependente da secreçãoplaquetária de ADP e é inibida na presença de apirase; HPU interage com a glicoproteína VI de membrana plaquetária (GPVI); as propriedades farmacológicas independentes da atividade ureolíticada HPU reforçam a hipótese de que essa proteína pode desempenhar umimportante papel na patogenicidade do H. Pylori incluindo a suacontribuição em doenças cardiovasculares.5. DiscussãoTratamento Plaquetário%  agregação plaquetáriamean ± sdNenhum 100.00      ± 10.24 Dexametasona   (50 mM) 62.64*     ± 6.06 Esculetina (500 mM) 55.00**      ± 6.06 Indometacina     (150 mM) 160.74***    ± 12.74(300 mM) 313.26***    ± 3.78Tabela 1. Envolvimento da fosfolipase A2 e eicosanóides na agregação plaquetáriainduzida por HPU. Plasma de coelhos rico em plaquetas (PRP) suspenso em placasmultiwell incubadas por 2 min em temperatura ambiente na ausência ou presença dasdrogas nas concentrações indicadas. A agregação foi induzida coma adição de HPU(300nM). Resultados com desvio calculado de 4 replicatas em cada condição. Valores dep <0,05* , p<0,01** ou p <0,001*** foram consideradas estatisticamente significantes. Investigar outros receptores de membranas envolvidos na agregaçãoinduzida por HPU; Usar microscopia confocal para estudar a ligação da HPU comreceptores de membrana com a adição de sondas fluorescentes.6. PerspectivasFigura 3. HPU induz secreção de ATP e agregação de plaquetas de coelhoinduzida por ADP: (A) Tempo de reação com secreção de plaquetas ativada por HPU(300 nM) ou colágeno (30 μg/mL) a secreção de ATP foi detectada pela luz emitidana presença de uma mistura de luciferina-luciferase. .R.U. – unidades relativas de luz.(B) Agregação plaquetária induzida por HPU (300 nM) ou 5 μM ADP é completamenteabolida na presença de 1 U/mL de apirase de batata. As plaquetas foram incubadascom apirase por 10 min em temperatura ambiente sem agitação, e depois a agregaçãofoi induzida pela adição de HPU ou ADP (tempo zero) e a agregação foi monitoradaturbidimetricamente por 8 min.

Portuguese

Urease de Helicobacter pylori e sua interação com receptores de membranas plaquetárias

Universidade Federal do Rio Grande do Sul

https://lume.ufrgs.br/bitstream/handle/10183/46119/Poster_7141.pdf?sequence=2&isAllowed=y

Urease de Helicobacter pylori e sua interação com receptores de membranas plaquetárias

Abstract

Similar works

Full text

Available Versions

Lume 5.8

Universidade Federal do Rio Grande do Sul