Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Entwicklung von monoklonalen Antikörpern
(mAk) zum Nachweis verschiedener relevanter Cephalosporin-Rückstände. Zu diesem
Zweck wurden einfache, schnelle und effiziente Verfahren zur Synthese von
Cephalosporin-Protein-Konjugaten entwickelt. Zur Gewinnung von Antikörpern wurden
Mäuse mit den entsprechenden, mittels aktiver-Ester-Methode an Trägerproteine
gekoppelten Cephalosporinen immunisiert. Mittels Zellfusion konnten verschiedene
Hybridom-Zelllinien etabliert werden, die mAk zum Nachweis von Cefalexin und
Ceftiofur sezernierten. Des Weiteren gelang es erstmals, auch mAk zum Nachweis von
Cefapirin, Cefoperazon und Cefquinom herzustellen. Basierend auf diesen mAk wurden
verschiedene, hauptsächlich indirekt kompetitive EIA-Verfahren entwickelt und für die
Analyse von Milch optimiert.
Hinsichtlich der angestrebten Sensitivität waren die in der VO (EU) Nr. 37/2010
festgelegten Rückstandshöchstmengen (MRL-Werte) maßgeblich. Alle mAks waren in der
Lage, ihr Ziel-Antibiotikum in Konzentrationen weit unterhalb des entsprechenden MRLWerts
nachzuweisen; die Nachweisgrenzen der optimierten EIA-Verfahren betrugen
0,3 ng/ml (Ceftiofur), 0,4 ng/ml (Cefquinom), 2,7 ng/ml (Cefalexin), 6,1 ng/ml
(Cefoperazon) bzw. 17,2 ng/ml (Cefapirin) und lagen damit ca. 3,5- bis 330-fach unterhalb
dem jeweiligen Grenzwert.
Die Spezifität der Antikörper wurde v. a. durch die C-7-Seitenkette des zur Immunisierung
verwendeten Cephalosporins geprägt. Nachweisbare Kreuzreaktionen der mAks traten
daher nur mit solchen Cephalosporinen auf, die einen strukturell verwandten C-7-
Substituenten aufwiesen. Diese kreuzreaktiven Cephalosporine sind jedoch nicht zur
Therapie Lebensmittel liefernder Tiere zugelassen. Mit Ausnahme von Ceftiofur
ermöglichen die Antikörper daher den substanzspezifischen Nachweis von Cephalosporin-
Rückständen in Lebensmitteln.
Die Anwendbarkeit der etablierten EIA-Verfahren zum Nachweis von Rückständen in
Milch wurde anhand künstlich dotierter Milchproben überprüft. In einem
Konzentrationsbereich entsprechend dem ½-, 1- sowie 2-fachen des jeweiligen MRLWerts
von 20 – 100 μg/kg wurden Wiederfindungsraten von 90 – 120 % erreicht.
Damit stehen erstmals unter Routinebedingungen einsetzbare quantitative
immunchemische Analyseverfahren zur Verfügung, die den spezifischen Nachweis fast
aller der derzeit in der Therapie von Lebensmittel liefernden Tieren eingesetzten
Cephalosporine weit unterhalb der festgelegten Rückstandshöchstmengen ermöglichen