Evolutionarily conserved signaling pathways mediate cell-cell communications during development. While the extracellular signal is precisely regulated to achieve dynamic morphogenetic events at the species level, it must be also flexible to generate the diversified morphologies through evolution. However, little is known about the mechanisms behind the precision and flexibility. The insect wing vein pattern can provide an excellent model to address this fundamental question, since species-specific wing vein patterns have been diversified through evolution. In this thesis, I study how evolutionarily conserved bone morphogenetic protein (BMP)-type ligand specifies diversified insect wing vein patterns using Dipteran Drosophila melanogaster and Hymenopteran sawfly Athalia rosae as models.
In Drosophila, BMP-type ligand Decapentaplegic (Dpp) is expressed in the longitudinal veins (LVs) to maintain LVs and induce crossveins (CVs) fates during pupal stages. However, the distribution of Dpp remained largely unknown. Using GFP-tagged Dpp, I demonstrated that Dpp is directionally transported from LVs into the posterior crossvein (PCV) region by two extracellular BMP-binding proteins, Short gastrulation (Sog) and Crossveinless (Cv). In contrast, most of Dpp did not diffuse from LVs by Type I BMP receptor and a positive feedback mechanism. Thus the active transport and retention mechanisms allow diffusible Dpp to draw the complex wing vein patterns in Drosophila.
To investigate how BMP signal instructs wing vein morphogenesis that involves apposition and cell shape changes between two wing epithelial layers, I then focused on the function of RhoGAP Crossveinless-C (Cv-C) during the PCV morphogenesis. I found that cv-c mediates PCV morphogenesis downstream of BMP signal by inactivating various Rho-type small GTPases. Interestingly, I found that cv-c is also required for Dpp transport, while Sog/Cv mediated BMP signal is guided at the ectopic wing veins caused by loss of Rho-type small GTPases. These observations identified a feed-forward mechanism coupling Dpp transport and PCV morphogenesis.
To address how BMP signal specifies diversified insect wing vein patterns, I then introduced sawfly as a new model. I found that dpp is ubiquitously expressed but BMP signal reflects distinct fore- and hindwing vein patterns in sawfly. To address if Dpp transport mechanism is involved in wing vein formation, Cv/Tsg was identified from sawfly. Loss of dpp or cv/tsg by RNAi affected BMP signal and all of wing venations. These observations suggest that ubiquitously expressed Dpp is redistributed to specify distinct fore- and hindwing vein patterns in sawfly.
Taken together, I found that the extracellular distribution of Dpp/BMP is tightly regulated and coordinated to achieve precise patterning and morphogenesis of the insect wing veins. Furthermore, this study raises an interesting possibility that changes in the directionality of Dpp/BMP diffusion may underlie distinct insect wing vein patterns.Evoluution aikana konservoituneet signalointireitit välittävät solujen välistä viestintää kehityksen aikana. Sen lisäksi, että lajitasolla solunulkoinen signaali on tarkasti säädelty dynaamisten morfogeenisten tapahtumien saavuttamiseksi, sen on oltava myös joustava luodakseen monipuolisia morfologioita kautta evoluution. Tästä huolimatta näistä tarkkuudesta ja joustavuudesta vastaavista mekanismeista tiedetään vähän. Hyönteissiiven laskimokuviointi tarjoaa erinomaisen mallin tämän perustavanlaatuisen kysymyksen tutkimiseksi, sillä lajikohtaiset siipien laskimokuvioitukset ovat monipuolistuneet evoluution edetessä. Tässä väitöskirjatyössä tutkin kuinka evoluutiossa konservoitunut bone morphogenetic protein (BMP) -tyypin ligandi määrittää monimuotoisia hyönteissiiven laskimokuvioita käyttäen kaksisiipisiin kuuluvaa banaanikärpästä (Drosophila melanogaster) ja lehtipistiäisiin kuuluvaa rapsipistiäistä (Athalia rosae) malleina.
Drosophila-mallissa BMP-tyypin ligandi Decapentaplegic (Dpp) ilmentyy pitkittäissuonissa niiden ylläpitämiseksi ja poikittaissuonten indusoimiseksi kotelovaiheiden aikana. Dpp:n jakaantuminen on kuitenkin pysynyt pitkälti tuntemattomana. Käyttäen GFP-leimattua Dpp:tä osoitin, että kaksi BMP:tä sitovaa proteiinia, Short gastrulation (Sog) ja Crossveinless (Cv), kuljettaa Dpp:n pitkittäissuonista posterioriselle poikittaissuonialueelle (PCV). Sitä vastoin suurin osa Dpp:stä ei diffundoitunut pitkittäissuonista tyypin I BMP-reseptorin ja positiivisen takaisinkytkentämekanismin välityksellä. Täten aktiivinen kuljetus ja retentiomekanismit antavat diffundoituvan Dpp:n piirtää banaanikärpäsen monimutkaiset siipilaskimokuviot.
Tutkiakseni kuinka BMP-signaali ohjeistaa siipilaskimoiden morfogeneesiä, johon liittyy appositiota ja solujen muodon muutoksia siiven kahden epiteelikerroksen välissä, keskityin RhoGAP Crossveinless-C:n (Cv-C) toimintaan PCV:n morfogeneesin aikana. Löysin, että cv-c välittää PCV:n morfogeneesiä BMP-signaalista alavirtaan inaktivoimalla erinäisiä Rho-tyypin pieniä GTPaaseja. Kiinnostavana löytönä huomasin cv-c:n myös olevan välttämätön Dpp:n kuljetukselle, kun Sog/Cv-välitetty BMP-signaali kulkee ohjatusti ektooppisissa siipilaskimoissa Rho-tyypin pienten GTPaasien inaktivoitumisen takia. Näiden havaintojen avulla tunnistin Dpp-kuljetuksen ja PCV:n morfogeneesin yhteen liittävän positiivisen takaisinkytkentämekanismin.
Selvittääkseni kuinka BMP-signaali määrittää monipuolisia hyönteissiiven laskimokuvioita, otin käyttöön rapsipistiäisen uutena mallina. Rapsipistiäisessä huomasin dpp:n ilmentyvän kaikkialla, mutta BMP-signaalin kuvaavan erillisiä etu- ja takasiiven laskimokuvioita. Dpp:n kuljetusmekanismin osuuden selvittämiseksi siipilaskimoiden muodostumisessa Cv/Tsg tunnistettiin rapsipistiäisessä. dpp:n tai cv/tsg:n hiljentäminen RNA-interferenssillä vaikutti BMP-signaaliin ja kaikkiin siipilaskimoihin. Nämä havainnot antavat ymmärtää, että kaikkialla ilmentyvä Dpp jakaantuu uudelleen rapsipistiäisen etu- ja takasiipien erillisten laskimokuvioiden määrittämiseksi.
Kaiken kaikkiaan löysin, että solunulkoinen Dpp/BMP:n jakaantuminen on tiukasti säädelty ja koordinoitu tarkan kuvioinnin ja morfogeneesin saavuttamiseksi hyönteissiipien laskimoissa. Lisäksi tämä tutkimus tuo esiin mielenkiintoisen mahdollisuuden siitä, että vaihtelut Dpp/BMP:n diffundoitumisen suuntautumisessa voivat olla erilaisten hyönteissiiven laskimokuvioiden takana
