Preclinical evaluation of common markers and iohexol for the development of intestinal permeability tests in dogs : Studies on laboratory Beagle dogs and Sprague-Dawley rats

Abstract

Intestinal permeability testing is the specific method to assess for a defective intestinal epithelial barrier. Intestinal permeability measurements are considered helpful and non-invasive means to evaluate intestinal mucosal damage for both scientific (particularly) and clinical purposes, and have been widely used in laboratory rodents and humans. Despite their many advantages, permeability tests have not gained widespread use as a testing option for the detection and management of canine intestinal disorders in veterinary clinical research. The main reasons for this may include the lack of an optimal biomarker for permeability testing, impracticalities involving current testing methodologies, and inconsistencies in test results that have been found by investigators using these tests. Chromium 51-labeled ethylenediamine tetra-acetic acid (51Cr-EDTA) is widely considered the most accurate intestinal permeability probe, but the use of radioactivity is a major drawback. Sugar biomarkers such as lactulose and rhamnose have been more commonly used in the recent years, but they have been associated with marked inconsistencies in the test results. Iohexol is a contrast medium commonly used in radiology for diagnostic purposes in human and veterinary patients, but this molecule has more recently been successfully used for the screening of gut mucosal damage in laboratory rats and humans. The main advantage of iohexol is that its use does not involve radioactivity, nor is it degraded in the intestinal lumen. Furthermore, it has the potential to be quantified by different analytical techniques. The main objective of this project was to improve the methodology of the intestinal permeability tests in dogs in order to make the testing simpler, more practical and accurate for veterinarians and researchers using this approach to investigate intestinal mucosal damage and disorders associated with a defective intestinal epithelial barrier. An additional objective was to preliminarily assess the use of iohexol as a novel intestinal permeability marker for use in dogs. The work consisted of preclinical comparisons of the most relevant intestinal permeability markers including 51Cr-EDTA, lactulose and rhamnose, and iohexol performed in both urine and blood tests using laboratory dog and rat models. In conclusion, studies on the percentage urinary recovery of 51Cr-EDTA, lactulose, and rhamnose, as well as D-xylose, 3-O-methyl-D-glucose, and sucrose after their oral simultaneous administration provided normative data for healthy adult male Beagle dogs. The analysis revealed a discrepancy in the percentage urinary recovery between 51Cr-EDTA and lactulose, suggesting that these two markers are not as equivalent as has so far been believed based on previous studies in humans and cats. It was also concluded that the use of a single marker provides comparable test results to the use of two markers, as evidenced by a comparison of recovery values from 51Cr-EDTA and lactulose versus their correspondent ratio against rhamnose. This supports the hypothesis that, in contrast to the dual sugar test, the use of one inert larger probe may be sufficient for permeability testing, and the testing procedure may consequently be considerably simplified. The studies also demonstrated that the 51Cr-EDTA permeability blood test based on the collection of at least two serum or plasma specimens gives comparable results to the 6-h cumulative urine test. The blood approach is much easier than the urine-based test, as it avoids the constraints associated with urine collection in dogs. Iohexol was shown to have a clear relationship with 51Cr-EDTA in serum levels when they were simultaneously administered to Beagle dogs. When it was used as an intestinal permeability probe in laboratory rats before and after the induction of a well-characterized experimental form of inflammatory bowel disease, it was also possible to clearly discriminate between healthy animals and rats with intestinal mucosal damage. The iohexol blood test can therefore be considered a promising tool for assessing canine intestinal permeability in veterinary clinical research. Nevertheless, further studies using iohexol as intestinal permeability blood marker, particularly in diseased dogs, are warranted before firm conclusions can be made on the validity of this test.Yleisten merkkiaineiden ja joheksolin laboratorioarviointi ja koiran suolen läpäisevyystutkimusten kehittäminen beaglekoirilla ja Sprague–Dawley-rotilla. Suolen läpäisevyystesteillä tutkitaan, onko suolen pintaepiteelissä vaurio. Näitä testejä on käytetty runsaasti laboratoriojyrsijöillä ja ihmisillä ja ne ovat hyödyllisiä ja kajoamattomia suolen limakalvovaurion tutkimuskeinoja sekä (etenkin) tutkimuksessa että hoidossa. Monista eduista huolimatta näitä testejä ei vielä käytetä laajasti koirien suolistosairauksien diagnosointiin ja hoitoon. Tämä johtunee lähinnä siitä, että testaukseen sopivaa optimaalista biomarkkeria ei ole, nykyiset testausmenetelmät ovat hankalia ja tulosten on huomattu vaihtelevan. 51Cr-EDTAa pidetään tarkimpana suolen läpäisevyyden markkerina, mutta se on radioaktiivista. Sokeribiomarkkereiden kuten laktuloosin ja ramnoosin käyttö on laajentunut viime vuosina, mutta testitulokset ovat vaihdelleet huomattavasti. Joheksoli on ihmisillä ja eläimillä yleisesti käytetty röntgenvarjoaine, jota on käytetty myös suolen limakalvovaurioiden seulontaan laboratoriorotilla ja ihmisillä. Joheksoli ei ole radioaktiivista eikä hajoa suolessa, ja sen määrä pystytään mittaamaan eri tekniikoilla. Tutkimuksen päätavoitteena oli kehittää suolen läpäisevyystestausta, jotta koirat voitaisiin tutkia aiempaa helpommin, kätevämmin ja tarkemmin suolen limakalvovaurioiden ja suolen epiteeliä vaurioittavien tautien varalta. Tutkimuksessa arvioitiin myös alustavasti joheksolin käyttöä uutena suolen läpäisevyyden merkki-aineena koirilla. Tutkimuksessa verrattiin prekliinisesti tärkeimpiä suolen läpäisevyyden merkkiaineita, mm. 51Cr-EDTAa, laktuloosia, ramoosia ja joheksolia, laboratoriokoirien ja rottien virtsa- ja verinäytteiden avulla. Tulokset 51Cr-EDTAn, laktuloosin, ramnoosin, D-ksyloosin, 3-O-metyyli-D-glukoosin ja sakkaroosin erittymisestä virtsaan tuottivat tietoa terveiden aikuisten urosbeaglejen viitearvoista. 51Cr-EDTAn ja laktuloosin prosentuaalisessa erittymisessä virtsaan havaittiin eroja, joten nämä merkkiaineet saattavat erota toisistaan enemmän kuin ihmis- ja kissakokeiden perusteella on luultu. 51Cr-EDTAn ja laktuloosin erittymisen ja niiden ja ramnoosin erittymissuhteen vertailu osoitti, että yhdellä merkkiaineella saadaan yhtä hyvät tulokset kuin kahdella. Tämä tukee käsitystä, että testaus voidaan toteuttaa kahden sokerin sijasta vain yhdellä inertillä, suurimolekyylisellä merkkiaineella, mikä voi helpottaa suuresti testausta. Tutkimukset osoittivat myös, että 51Cr-EDTAn määritys vähintään kahdesta verinäytteestä tuottaa yhtä hyvät tulokset kuin 6 tunnin virtsankeräykseen perustuva koe. Veritestaus on huomattavasti helpompaa kuin koirien virtsan kerääminen ja testaus. Seerumin joheksoli- ja 51Cr-EDTA-pitoisuuksien todettiin korreloivan selvästi, kun beagleille annettiin molempia. Kun laboratoriorottien suolen läpäisevyyttä tutkittiin joheksolilla sekä ennen kokeellisen tulehduksellisen suolistosairauden induktiota ja sen jälkeen, tuloksista nähtiin selvästi, oliko suolen limakalvo terve vai vaurioitunut. Joheksoliverikoe on siis lupaava työkalu koiran suolen läpäisevyyden arviointiin. Joheksoliverikokeen käyttöä suolen läpäisevyyden tutkimiseen on silti hyvä arvioida tarkemmin etenkin sairailla koirilla ennen kuin kokeen luotettavuudesta tehdään varmoja johtopäätöksiä