Dioxins are pervasive environmental contaminants, to which people are generally exposed through foods of animal origin. Children, before and after birth, are especially susceptible to their toxicity, while the risks to adults seem quite small at current exposure levels. The dioxins bind to a specialised intracellular AH receptor, directly influencing the expression of a substantial number of genes and resulting to variable toxicity depending on the affected species and the strain, as well as the gender and age of the individual. This is exemplified in the dramatic variability of the acute toxicity of the most potent dioxin (2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin [TCDD]) within one species: H/W rats tolerate over 1000-fold larger doses than the L E strain. On the other hand, one of the few unifying features of acute TCDD intoxication in many laboratory species is a dramatic feed intake reduction and weight loss, termed the wasting syndrome.
In this research, the pathophysiological challenge of wasting was tackled in two studies by measuring the effect of one dose of TCDD on hypothalamic mRNA levels of AHR-related proteins and feeding regulatory factors in the resistant H/W and sensitive L E rats. In the latter two experiments the perviously-employed quantitative reverse transcription PCR (RT-qPCR) methodology was refined: A set of stable reference genes for RT-qPCR was first sought, and then the identified reference genes were employed in a study comparing the robustness of various RT and qPCR enzymes and mapping the RT-qPCR variation sources.
The small constitutive and TCDD-induced differences in the hypothalamic mRNA expression of some AHR signalling cascade molecules between L E and H/W rat are most likely not causally related to the wasting syndrome. However, a functional AHR signalling cascade appears to be present in the hypothalamus. The lack of any drastic changes in hypothalamic neuropeptide or receptor mRNA following TCDD treatment speak against a severe cytotoxic effect on, or permanent hyperexcitation of the cells. Notably, the employed hypothalamic block sampling might miss expression changes confined to a localised point and omits the various extra-hypothalamic systems in eating regulation. The future studies should thus be targeted to individual nuclei, but to also have a wider scope of eating regulation both inside and outside CNS.
The number of genes displaying an acceptable steadiness of expression in the face of lethal TCDD toxicity is small and besides this the RT stability has a strong influence on the usability of the potential reference genes. Furthermore, RT variance markedly exceeds qPCR variance, stressing the importance of replication at the RT level. Finally, linear hierarchical models and Bayesian inference offer an efficient way to build a coherent statistical model of the whole RT-qPCR experiment maximising the use of the data.Dioksiinit ovat kaikkialle maapallolle levinneitä ympäristömyrkkyjä, joille suomalaiset altistuvat lähinnä eräiden Itämeren kalojen välityksellä. Sikiönkehitys ja lapsuus ovat erityisen alttiita dioksiinien myrkkyvaikutuksille, mutta aikuisille niiden aiheuttama vaara nykyisillä altistustasoilla lienee melko pieni. Elimistössä dioksiinit sitoutuvat solunsisäisen AH-reseptoriin, joka aktivoituessaan muuttaa satojen geenien ilmentymistä. Nämä ilmentymismuutokset, ja lopulta haitalliset vaikutukset elimistössä, näyttävät kuitenkin riippuvan eläinlajista, -kannasta iästä ja kudoksesta jossa aktivaatio tapahtuu. Dioksiinien myrkyllisyyden mekanismit ovatkin huonosti ymmärrettyjä. Esimerkki myrkyllisyyden vaihtelevuudesta on kahden rottakanan herkkyysero myrkyllisimmälle 2,3,7,8-tetraklooridibentso-p-dioksiinille eli TCDD:lle: H/W-kannan rotat kestävät yli 1000 kertaa suurempia myrkkyannoksia kuin L E-kanta. Dioksiinien yksi harvoista monilla koe-eläimillä samanlaista, mutta herkkyyseroiltaan yhtä suurista, vaikutuksista on jo yhden myrkyllisen annoksen aiheuttama voimakas ruokahalun ja painon lasku, niin sanottu näivettymisoireyhtymä.
Tutkimuksessani pyrin selvittämään näivettymisoireyhtymän mekanismeja altistamalla H/W- ja L E-rottia yhdelle annokselle TCDD:tä ja mittaamalla geenien ilmentymisen muutoksia hypotalamuksessa kvantitatiivista käänteiskopiointi-PCR (RT-qPCR) -menetelmää käyttäen. Mitatut lähetti-RNA:t tuottavat AH-reseptorin signalointiin liittyviä proteiineja ja syömisen säätelyyn liittyviä neuropeptidejä tai reseptoreita. Väitöskirjan toisessa osassa parannettiin herkän RT-qPCR-menetelmän luottavuutta etsimällä sen tarvitsemia kontrolligeenejä ja kartoittamalla käänteiskopiointi (RT)- ja PCR-reaktioiden virhelähteitä.
Hypotalamuksen AH-reseptorin signalointireitti toimii, mutta lähetti-RNA:n perustasot tai niiden vähäiset muutokset TCDD:n annostelun jälkeen eivät näytä selittävän H/W ja L E-kantojen herkkyyseroja. Neuropeptideissä todettiin vain pieniä muutoksia, joten TCDD ei aiheuttane hypotalamuksen syömistä säätelevän järjestelmän solujen merkittäviä toiminnan muutoksia. Mittaukset tehtiin kokonaisista kudospaloista ja tämä voi estää tumaketason vaikutusten havaitsemisen, eikä myöskään huomioi tärkeitä hypotalamuksen ulkopuolisia syömistä ja energiatasapainoa sääteleviä järjestelmiä. TCDD:n aiheuttamiin myrkkyvaikutuksiin reagoimattomia kontrolligeenejä löytyi neljä ja näistä kahden lähetti-RNA:n käänteiskopiointi toimi luotettavasti. RT-qPCR-menetelmän analysointiin käytetty lineaarinen hierarkkinen malli ja beyesiläinen päättely toimivat hyvin RT- ja PCR-reaktioiden virhelähteiden erottelussa. Tämän tutkimuksen tulokset auttavat suuntaamaan tulevia näivettymisoireyhtymätutkimuksia ja parantamaan RT-qPCR-menetelmän luotettavuutta
