Several serious diseases remain without non-toxic curative treatments. To fill this void, one of the promising groups of medicines is that of oligonucleotides, encompassing aptamers, transcription factor decoys, and antisense therapeutics such as short interfering RNA and splice-correcting oligonucleotides. These short strands of DNA or RNA can bind to specific cellular nucleic acids or proteins and thereby inhibit or correct the function of disease-causing molecules. Extensive enzymatic degradation and poor cellular uptake are the most important obstacles for systemic oligonucleotide therapy. Numerous chemical modifications have been introduced to improve enzymatic stability, but they must be carefully optimized to avoid toxicity and to maintain target affinity. One solution is to design topological modifications, such as looped or circular oligonucleotides, which conserve the natural phosphodiester backbone but cannot be attacked by exonucleases.
Cellular uptake has proven to be even more challenging. Oligonucleotides are internalized into cells by endocytosis, after which they often remain trapped in endosomes. Therefore, it would be advantageous to develop delivery vectors capable of bypassing endocytic routes of uptake or enhancing endosomal escape. Cell-penetrating peptides, for example, exploit several mechanisms of uptake, some of which lead to rapid entry without endosomal localization. In addition, encouraging results have been achieved using liposomes, gold nanoparticles, and other nanocarriers, which also shield the oligonucleotide from degrading enzymes.
The aim of this work was to improve the in vitro delivery of oligonucleotides by employing chemical modifications and nanoparticle carriers. The synthesis of the compounds, their characterization by various analytical methods, and the evaluation of biological effects are described. Antisense oligonucleotides covalently linked to cell-penetrating peptides via convergent conjugation displayed improved cellular uptake but failed to inhibit reporter genes due to endosomal entrapment in cells. Circular oligonucleotides exhibited enhanced selectivity of mismatch detection and increased stability in biological fluids compared to linear oligonucleotides. Altogether 44 compounds were analyzed by electrospray ionization mass spectrometry and liquid chromatography mass spectrometry, which were found to be excellent methods for the characterization of modified oligonucleotides. Finally, we synthesized cationic gold nanoparticles modified with a Tat-related peptide, which did not adversely affect cell viability and effectively delivered short interfering RNA into cells as non-covalent complex.Monet parantumattomat sairaudet johtuvat haitallisten proteiinien syntymisestä elimistössä. Näiden proteiinien toimintaa pyritään estämään yleisimmin perinteisillä pienimolekyylisillä lääkeaineilla. Vielä tehokkaampi ja turvallisempi vaikutus voidaan saada estämällä haitallisten proteiinien syntyminen jo RNA-tasolla esimerkiksi oligonukleotidilääkkeillä. Nämä lyhyet nukleiinihappomolekyylit sitoutuvat spesifisesti kohde-RNA:han ja voivat hajottaa sen useilla eri mekanismeilla. Ne voivat myös korjata RNA:n viallista prosessointia tai sitoutua suoraan kohdeproteiiniin. Oligonukleotideja tutkitaan muun muassa syöpien ja parantumattomien geneettisten sairauksien hoitoa varten. Tähän mennessä vain yksi ei-paikallinen oligonukleotidilääke on hyväksytty kliiniseen käyttöön Yhdysvalloissa, mutta toksisuuden takia sen käyttö on tarkoin rajattu eikä sitä ole hyväksytty Euroopassa.
Ongelmana hoitojen kehittämisessä on oligonukleotidien entsymaattinen hajoaminen elimistössä sekä niiden huono pääsy solujen sisään. Oligonukleotideja on muunneltu entsyyminkestäviksi muokkaamalla niiden kemiallista rakennetta, mutta tällöin toksisuus voi lisääntyä ja tehokkuus heikentyä. Oligonukleotidi voidaan myös naamioida entsyymeiltä muuttamatta luonnollista nukleotidirankaa, jos se syklisoidaan liittämällä nukleotidiketjujen päät toisiinsa. Kolmas vaihtoehto on liittää oligonukleotidi sopivaan kantajamolekyyliin, jonka läsnäolo suojaa oligonukleotidia entsyymeiltä ja lisäksi auttaa sen vaikutuspaikalleen solun sisään. Lupaavia kantajia ovat muun muassa liposomit, polymeeri- ja kultananopartikkelit sekä soluun penetroituvat peptidit, joista viimeksi mainitut on löydetty tutkittaessa virusten tehokasta pääsyä soluihin. Näiden peptidien toivotaan pystyvän ohittamaan endosytoosireitin, jonka kautta soluun kulkiessaan oligonukleotidi voi jäädä loukkuun endosomiin.
Tässä väitöskirjatyössä tutkittiin kemiallisten rakennemuunnosten ja nanopartikkelikantajien mahdollisuuksia oligonukleotidien saattamisessa soluihin. Osatöissä paitsi tutkittiin muunnosten ja kantajien biologisia vaikutuksia, myös optimoitiin synteesi- ja analyysimenetelmiä. Kovalentisti liitetyt soluun penetroituvat peptidit paransivat oligonukleotidien soluunottoa, mutta antisense-vaikutusta ei silti nähty soluissa yhdisteiden juututtua endosomeihin. DNA-diagnostiikkaa varten valmistetut sykliset oligonukleotidit osoittautuivat huomattavasti lineaarisia oligonukleotideja selektiivisemmiksi emäsmutaatioiden havaitsemisessa, ja myös niiden entsyyminkestävyys oli parempi. Yhteensä 44 yhdistettä analysoitiin sähkösumutusmassaspektrometrialla ja nestekromatografia massaspektrometrialla, jotka sopivat erinomaisesti muunneltujen oligonukleotidien analysointiin. Viimeisessä osatyössä syntetisoitiin kationisia kultananopartikkeleita, joihin lisättiin peptidianalogi. Tähän kantajaan kompleksoidulla pienellä häiritsevällä RNA:lla (siRNA:lla) hiljennettiin rekombinanttisolujen ilmentämä reportterigeeni heikentämättä solujen elävyyttä
