This thesis is based on the original observation of an allelic deletion of the recently described Neuron navigator 3 (NAV3) gene in patients with primary cutaneous T-cell lymphoma (CTCL) and CTCL-associated lung cancer. Thereafter mutations or copy number changes of NAV3 have been reported in melanoma, glioblastoma (GBM) and adrenal carcinoma. The aim of this study has been to shed light on the function and interactions of the NAV3 protein, as well as characterizing NAV3 copy number changes and their effect on patient survival in several forms of cancer.
NAV3 is a novel cancer-associated gene at 12q21. The specific function of NAV3 is not known except that it carries actin-binding domains with ATPase activity, and is therefore likely to have an action on microtubules and cytoskeleton reorganization. The three Navigator genes, NAV1, NAV2 and NAV3 share homology among themselves and among different species. This suggests a central role for the encoded proteins in cell biology.
In this study, NAV3 copy number changes have been studied by fluorescence in situ hybridisation (FISH) and array comparative genomic hybridisation (aCGH) in non-melanoma skin cancers, colorectal cancer and neural system tumours, and the relevant NAV3-regulated target genes have been identified. Furthermore, the expression levels of NAV3 and NAV3-regulated signalling molecules have been correlated to disease progression and patient outcome.
In Basal cell carcinomas (BCC) and Squamous cell carcinomas (SCC) we found NAV3 copy number loss and corresponding absence of protein in 21% of the BCC and in 25% of the SCC tumours. In the nodular/superficial BCC subgroup, also low-level NAV3 amplification was found. NAV3 aberrations were independent of the known chromosome 6 amplification in BCC. Chromosome 12 polysomy, also independent of chromosome 6 polysomy, was found in 33% and 25% of the invasive type of BCC and in SCC, respectively.
In colorectal carcinomas NAV3 deletion and chromosome 12 polysomy were detected in 30% and 70% of MSS carcinomas, and in 12.5% and 50% of MSI carcinomas, but also in 23% and 30% of adenomas, respectively. Low copy number amplification of NAV3 was found in 25% of MSS samples.
119 patient samples representing different central and peripheral nervous system tumours were studied for NAV3 copy number changes. Neuronally differentiated tumours (neuroblastomas and medulloblastomas) entailed more NAV3 aberrations than the glial tumours. In glial tumours, those with grade IV (gliobalstoma (GBM)) had significantly more NAV3 deletions than tumours with grades I, II or III. Log rank analysis also linked NAV3 deletion to a poor prognosis in gliomas. In contrast, glioma patients with NAV3 amplification showed better prognosis than those with normal NAV3 copy numbers. The FISH result was also supported by aCGH analysis, which showed results matching the FISH analysis for tumour samples with NAV3 amplification and deletion.
To understand the in vivo functional consequences of NAV3 copy number changes, especially of NAV3 deletion, we silenced NAV3 in normal colon, GBM and primary keratinocyte cells, using a commercially available small inhibitory ribonucleic acid (siRNA) construct. Post transfection RNA samples from several time points were analyzed with Agilent 44K microarray. In GBM and colorectal cell lines we identified, among others, GnRHR and IL-23R as upregulated by NAV3 gene silencing. The upregulation of the selected genes were confirmed by quantitative PCR. In primary keratinocytes, NAV3 silencing led to consistent upregulation of 22 annotated genes, and several Wnt/HH pathway genes were slightly overexpressed too.
Taken together the results of this thesis support the previously suggested role of NAV3 as a novel cancer associated gene, and we suggest that NAV3 affects the malignant potential of a given tumour through multiple pathways. This assumption is based on the fact that gene expression analysis of NAV3 silenced cells indicates that NAV3 affects genes with involvement in both inflammation and carcinogenesis.Tämä väitöskirja perustuu alkuperäishavaintoon, jossa hiljattain kuvatun Neuron navigator 3 (NAV3) geenin deletio osoitettiin esiintyvän ihon t-solulymfoomissa sekä näihin liittyvissä keuhkosyövissä. Tämän jälkeen NAV3:n kopiolukumuutoksia on osoitettu myös melanoomissa, glioblastoomissa ja lisämunuaissyövissä. Tämän tutkimuksen tarkoituksena on ollut selventää NAV3 proteiinin funktiota ja vuorovaikutuksia muiden proteiinien kanssa. Lisäksi tutkittiin NAV3 kopiolukumuutoksia sekä niiden vaikutuksia potilasennusteeseen useassa eri syöpätyypissä. -------- NAV3 on uusi syöpään liitetty geeni kromosomissa 12q21. NAV3:n tarkkaa toimintaa ei tiedetä, lukuun ottamatta sitä, että siinä on aktiiniin sitoutuva osa joka toimii ATPaasina. Täten NAV3 luultavimmin vaikuttaa mikrotubuluksiin ja solutukirangan uudelleen järjestelyyn. Kolme Navigator geeniä, NAV1, NAV2 ja NAV3 ovat homologisia sekä keskenään että eri lajien kanssa, mikä antaa viitteitä proteiinien tärkeistä toiminnoista solubiologiassa.
Tässä tutkimuksessa NAV3 kopiolukumuutoksia tutkittiin ihosyövissä (ei melanooma), paksusuolen syövissä sekä keskushermoston syövissä kahdella eri menetelmällä: fluorescence in situ hybridisaatio (FISH) ja array comparative genomic hybridisaatio (aCGH). Lisäksi löydettiin useita NAV3:n kohdegeenejä ja selvitettiin NAV3:n ja tämän kohdegeenien ilmentymistasojen vaikutusta tautien etenemiseen.
Tyvisolusyövissä (BCC) ja okasolusyövissä (SCC) NAV3 deletio ja siihen liittyvä NAV3 proteiinitason lasku löydettiin 21%:ssa BCC ja 25%:ssa SCC tapauksia. BCCn nodulaarisessa/pinnallisessa alamuodossa löydettiin myös NAV3 amplifikaatioita. Nämä muutokset olivat riippumattomia BCC:n tunnetusta kromosomi 6:n amplifikaatiosta. Kromosomin 12 polysomiaa havaittiin 33 %:ssa invasiivista BCC:tä ja 25 %:ssa SCC:tä. Nämä olivat myös riippumattomia kromosomi 6:n muutoksista.
Paskusuolen syövässä NAV3 deletioita havaittiin 30%:ssa ja kromosomi 12 polysomiaa 70%:ssa MSS tapauksia, ja vastaavasti 12.5%:ssa ja 50%:ssa MSI tapauksia, mutta myös 23%:ssa ja 30%:ssa adenoomia. Alhaisen tason NAV3 amplifikaatioita löydettiin 25%:ssa MSS näytteitä.
119 näytettä eri keskushermoston syövistä tutkittiin NAV3 kopiolukumuutosten varalta. Neuronaalisesti erilaistuneista syövistä (neuroblastoomat ja medulloblastoomat) löytyi enemmän NAV3 kopiolukumuutoksia kuin glioomista. Glioomissa gradus IV luokan syövissä (glioblastoomat) löytyi enemmän muutoksia kuin alhaisemman luokituksen syövissä (gradus I-III). Log rank analyysi yhdisti myös NAV3 deletion huonoon ja NAV3 amplifikaation hyvään ennusteeseen glioomissa. Myös aCGH analyysi tuki FISH tuloksia sekä amplifikaatioiden että deletioiden osalta.
Ymmärtääksemme NAV3 kopiolukumuutosten (erityisesti deletion) vaikutuksia in vivo, NAV3 geeni vaimennettiin kohdennetun siRNA konstruktin avulla normaalisuolen soluissa, glioblastoomasoluissa sekä primäärisissä keratinosyyteissä. Vaimennuksen jälkeisiä RNA näytteitä useasta aikapisteestä analysoitiin Agilentin 44K mikrosirujen avulla. Glioblastoomasoluissa ja normaali suolen soluissa havaittiin että solumembraanin reseptoreita koodaavien geenien GnRHR ja IL-23R ilmentyminen lisääntyi NAV3 vaimennuksen johdosta. Nämä ilmentymistason nousut varmennettiin myös kvantitatiivisen PCRn avulla. Primäärisissä keratinosyyteissä NAV3 vaimennus johti 22 geenin ilmentymistason nousuun, ja useat Wnt ja HH signalointireittien geenit olivat myös hiukan yli-ilmentyneitä.
Tiivistäen tämän väitöskirjan tulokset vahvistavat jo aikaisemmin ehdotettua NAV3:n roolia syöpään liittyvänä geeninä, ja ehdotamme että NAV3 vaikuttaa syöpäsolujen kasvuun usean eri signalointireitin kautta. Tämä olettamus perustuu siihen, että NAV3 näyttää säätelevän useaa geeniä, jotka liittyvät sekä elimistön tulehdusreaktioihin että syövän syntyyn
