Cancer is a complex disease. It is a multistep process where genetic changes lead to cellular transformation and uncontrolled proliferation. However, cancer is not only a disease of these transformed cells, since tumor stroma and microenvironment synchronously evolve and become activated together with these genetic changes. The interactions between different cell types in tumor microenvironment are mediated by soluble factors, such as cytokines, chemokines, growth factors and proteases. They modulate cell proliferation, activation and differentiation, as well as the composition of the extracellular matrix in tumor and its microenvironment.
Nemosis is an in vitro model of fibroblast activation, which is initiated by forcing fibroblast to cluster together instead of providing solid support for attachment. This results in a multicellular spheroid that upregulates soluble paracrine molecules known to be important mediators of tumor microenvironment. Furthermore, nemotic fibroblasts affect cancer cell proliferation, invasion and differentiation through these soluble factors. In addition to direct effects on cancer cells they stimulate angiogenesis and the chemotaxis of leukocytes.
This thesis study shows that fibroblast spheroid formation depends on the interaction between fibronectin (FN) with its integrin receptors, more accurately α5 and β1 integrin subunits, whereas fibroblasts activation in spheroids was mediated by the interaction of FN with α5, αV and β1 integrin subunits. The activation was mediated by the binding of integrins to the RGD -motif in FN molecules and the synergy site that is known to stimulate RGD-motif binding to integrins enhanced it. Unexpectedly, FN-matrix assembly was not essential for the activation of fibroblasts in spheroids although it had an effect on spheroid formation. FN deposit to matrix is an acknowledged consequence of integrin binding to fibronectin.
Nemosis was accompanied by a dramatic change in gene expression. The change could be roughly categorized in three classes; the upregulation of secreted molecules and downregulation of cell cycle and cytoskeleton. Nemosis was associated with a quiescent withdrawal from the cell cycle, as the cells downregulated cyclin D and upregulated p27, the driver and the inhibitor of the cell cycle, respectively. Furthermore, nemotic fibroblasts resumed to the cell cycle when taken out from the spheroid, indicating reversible cell cycle arrest, a known characteristic of quiescence. Fibroblast activation by spheroid formation was accompanied by stress-related changes in the cellular ultrastructure, such as dilated endoplasmic reticulum, increased lipofuscin and degenerated organelles. Hence, nemosis is a cellular stress response. This observation was in agreement with the induction of autophagy in fibroblasts spheroids. Autophagy is a well-known stress response that helps cell survival under stress conditions. Furthermore, nemosis resembled another cellular stress condition, the cellular senescence. They both had a similar secretory phenotype, expressed senescence-associated β-galactosidase and lipofuscin, and there was a cell cycle arrest in both. However, there were also features to distinguish nemosis from senescence, such as nemosis being a reversible phenotype, and cell cycle inhibitors that regulate senescence being downregulated in nemosis.
Nemosis attenuated tumor growth in vivo in a mouse xenograft model. The attenuation was associated with the expression of senescence-associated β-galactosidase and the expression of the p14ARF cell-cycle inhibitor in human RT3 malignant keratinocytes. This suggests that nemosis causes cellular senescence in the RT3 keratinocytes in vivo. In addition to the senescence response, nemosis was found to increase the cytokeratin-7 (CK7) mediated differentiation of RT3 cells in xenografts.
It is becoming obvious that cancer is not just a disease of uncontrolled proliferation of cancer cells, but a disease where normal stromal fibroblasts actively participate in its progression. The current work reveals new mechanistic insights of fibroblast activation and concludes that nemosis can be a useful model to study the activation of fibroblasts and interactions between fibroblasts and cancer cells.Syöpä on yleisnimike hyvin erilaisille sairauksille, joissa geneettisesti muuntuneet solut jakautuvat hallitsemattomasti. Se ei kuitenkaan ole pelkästään näiden muuntuneiden syöpäsolujen sairaus vaan syöpäkasvain koostuu lisäksi sidekudoksen (fibroblastit), immuunijärjestelmän ja verisuoniston soluista, eli strooman soluista. Strooman solut vaikuttavat merkittävästi kasvaimen kasvuun säätelemällä syöpäsolujen jakautumista ja erilaistumista erittämällä liukoisia välittäjäaineita sekä muuttamalla soluväliaineen rakennetta.
Syöpäkasvaimessa olevat fibroblastit ovat aktivoituneessa tilassa, jolloin ne erittävät ympäristöönsä tulehdusta sääteleviä välittäjäaineita sekä kasvutekijöitä. Kasvaimen fibroblastit muistuttavat haavan paranemisen aikana aktivoituneita fibroblasteja. Väitöskirjatutkimuksen tarkoituksena oli selvittää mekanismeja, jotka johtavat fibroblastien aktivoitumiseen sekä aktivoituneiden fibroblastien vuorovaikutuksia syöpäsolujen kanssa, hyödyntäen tutkimusryhmässämme löydettyä fibroblastien aktivoitumismallia, nemoosia.
Nemoosissa fibroblastit muodostavat monisoluisen sferoidin samalla aktivoituen tuottamaan tulehdusta sääteleviä välittäjäaineita ja kasvutekijöitä. Väitöskirjatyössä havaittiin sferoidin muodostumisen ja siinä olevien fibroblastien aktivoitumisen olevan riippuvainen soluväliaineessa löydettävän fibronektiinin ja sen reseptoreiden, integriinien, vuorovaikutuksesta. Sferoidin muodostuminen lisäsi autofagiaa fibroblasteissa. Autofagiassa solut kierrättävät vioittuneita soluelimiä sekä aggregoituneita proteiineja takaisin energian lähteeksi, parantaen näin solun eloonjäämistä vasteena kokemalleen stressille. Lisäksi sferoidissa olevat fibroblastit muuntuivat fenotyypiltään liukoisia välittäjäaineita ja kasvutekijöitä erittäviksi, samalla pysäyttäen solun jakautumisen ja vähentäen solutukirangan muodostavien proteiinien määrää. Nemoosiin liittyvä stressireaktio onkin hyvin samankaltainen mitä solut ilmaisevat vanhentuessaan (solusenesenssissä). Nemoosin havaittiin kuitenkin olevan eritavalla säädelty kuin solujen vanheneminen, lisäksi se oli palautuva fenotyyppi, kun taas solun vanhentuminen on aina palautumaton ilmiö. Fibroblastisferoidit hidastivat syöpäsolujen kasvua hiirissä aiheuttamalla niissä vanhentumisen sekä solujen erilaistumisen, jotka molemmat estävät solun jakautumista.
Tämä väitöskirjatyö paljastaa uusia solubiologisia mekanismeja, jotka johtavat fibroblastien aktivoitumiseen, sekä osoittaa että nemoosi on hyödyllinen malli syöpäsolujen ja fibroblastien vuorovaikutusten karakterisoimiseen
