The removal of noncoding sequences, or introns, from the eukaryotic messenger RNA precursors is catalyzed by a ribonucleoprotein complex known as the spliceosome. In most eukaryotes, two distinct classes of introns exist, each removed by a specific type of spliceosome. The major, U2-type introns account for over 99 % of all introns, and are almost ubiquitous. The minor, U12-type introns are found in most but not all eukaryotes, and reside in conserved locations in a specific set of genes. Due to their slow excision rates, the U12-type introns are expected to be involved in the regulation of the genes containing them by inhibiting the maturation of the messenger RNAs. However, little information is currently available on how the activity of the U12-dependent spliceosome itself is regulated.
The levels of many known splicing factors are regulated through unproductive alternative splicing events, which lead to inclusion of premature STOP codons, targeting the transcripts for destruction by the nonsense-mediated decay pathway. These alternative splice sites are typically found in highly conserved sequence elements, which also contain binding sites for factors regulating the activation of the splice sites. Often, the activation is achieved by binding of products of the gene in question, resulting in negative feedback loops.
In this study, I show that U11-48K, a protein factor specific to the minor spliceosome, specifically recognizes the U12-type 5' splice site sequence, and is essential for proper function of the minor spliceosome. Furthermore, the expression of U11-48K is regulated through a feedback mechanism, which functions through conserved sequence elements that activate alternative splicing and nonsense-mediated decay. This mechanism is conserved from plants to animals, highlighting both the importance and early origin of this mechanism in regulating splicing factors. I also show that the feedback regulation of U11-48K is counteracted by a component of the major spliceosome, the U1 small nuclear ribonucleoprotein particle, as well as members of the hnRNP F/H protein family. These results thus suggest that the feedback mechanism is finely tuned by multiple factors to achieve precise control of the activity of the U12-dependent spliceosome.Väitöskirjassani olen kuvannut lähetti-RNA:n silmukoimiseen osallistuvan proteiinin U11-48K toimintaa ja säätelyä. Lähetti-RNA:n silmukointi on välttämätön vaihe geenien ilmentymisessä, ja sen häiriöt voivat aiheuttaa sairauksia. Näin ollen silmukoinnin ja sen säätelymekanismien tunteminen ovat tärkeitä sekä yleisesti geenien ilmentymisen ymmärtämiselle että silmukoinnin häiriöistä aiheutuvien tautien diagnosoinnille ja hoidolle. Lisäksi väitöskirjassani kuvatut tulokset antavat viitteitä aitotumallisten eliöiden ja niiden lähetti-RNA:n muokkaukseen osallistuvien prosessien evoluutiosta.
Aitotumallisia eliöitä, kuten kasveja ja eläimiä, erottaa tumattomista eliöistä, kuten bakteereista ja arkeista, mm. niiden geenien rakenne. Aitotumallisten eliöiden geenit ovat tyypillisesti jakaantuneet proteiineja koodaaviin jaksoihin eli eksoneihin, joita erottavat toisistaan introneiksi nimitetyt jaksot. Geenien ilmentymisen ensimmäinen vaihe on DNA:n geenien sisältämän informaation kopioiminen lähetti-RNA:ksi, joka toimii mallina proteiinien synteesille. Proteiinisynteesin onnistumiselle on oleellista, että lähetti-RNA:sta poistetaan proteiinia koodaamattomat intronijaksot. Tämä silmukoinniksi nimitetty prosessi on siten välttämätön välivaihe aitotumallisten eliöiden geenien ilmentymiselle. Useimmissa aitotumallisissa eliöissä introneja on kahta toisistaan selvästi eroavaa alatyyppiä, jotka tunnetaan U2- ja U12-tyypin introneina.
Tässä tutkimuksessa olen selvittänyt U12-tyypin intronien silmukointia ja sen säätelyä. Tulokseni osoittavat, että proteiini U11-48K on välttämätön U12-tyypin intronien silmukoinnille, ja siten myös U12-tyypin introneja sisältävien geenien ilmentymiselle. Jotta näiden geenien toiminta ei häiriintyisi, on myös U11-48K-proteiinin määrää soluissa säädeltävä tarkasti. Väitöskirjassani osoitankin, että U11-48K:n ilmentymistä säädellään muuttamalla sitä itseään koodaavaan lähetti-RNA:n silmukointia: ylimääräiset U11-48K:ta koodaavat lähetti-RNA:t silmukoidaan poikkeavalla tavalla, mikä johtaa niiden tuhoamiseen ja proteiinisynteesin estymiseen.
Sekä U12-tyypin intronit että U11-48K-proteiinin määrää säätelevä mekanismi ovat säilyneet useimmilla hyvin kaukaista sukua olevilla aitotumallisilla eliöillä, kuten eläimilla ja kasveilla. Tämä viittaa siihen, että molemmat prosessit olivat olemassa jo kaikkien aitotumallisten eliöiden kantamuodossa, todennäköisesti noin miljardi vuotta sitten. Näiden mekanismien säilyminen näin pitkiä aikoja osoittaa, että niillä on ja on ollut merkittävä rooli aitotumallisten eliöiden, myös ihmisen, elintoimintojen kannalta. Aiemmissa tutkimuksissa onkin todettu useiden perinnöllisten sairauksien johtuvan silmukointimekanismien häiriöistä. Näin ollen on mahdollista että kuvaamani säätelymekanismin häiriöt saattavat myös olla osallisena joihinkin toistaiseksi määrittämättömiin periytyviin tauteihin
