The protein kinases (PKs) belong to the largest single family of enzymes, phosphotransferases, which catalyze the phosphorylation of other enzymes and proteins and function primarily in signal transduction. Consequently, PKs regulate cell mechanisms such as growth, differentiation, and proliferation. Dysfunction of these cellular mechanisms may lead to cancer, a major predicament in health care. Even though there is a range of clinically available cancer-fighting drugs, increasing number of cancer cases and setbacks such as drug resistance, constantly keep cancer research active.
At the commencement of this study an isophthalic acid derivative had been suggested to bind to the regulatory domain of protein kinase C (PKC). In order to investigate the biological effects and structure-activity relationships (SARs) of this new chemical entity, a library of compounds was synthesized. The best compounds induced apoptosis in human leukemia HL-60 cells and were not cytotoxic in Swiss 3T3 fibroblasts. In addition, the best apoptosis inducers were neither cytotoxic nor mutagenic. Furthermore, results from binding affinity assays of PKC isoforms revealed the pharmacophores of these isophthalic acid derivatives. The best inhibition constants of the tested compounds were measured to 210 nM for PKCα and to 530 nM for PKCδ.
Among natural compounds targeting the regulatory domain of PKC, the target of bistramide A has been a matter of debate. It was initially found to activate PKCδ; however, actin was recently reported as the main target. In order to clarify and to further study the biological effects of bistramide A, the total syntheses of the natural compound and two isomers were performed. Biological assays of the compounds revealed accumulation of 4n polyploid cells as the primary mode of action and the compounds showed similar overall antiproliferative activities. However, each compound showed a distinct distribution of antimitotic effect presumably via actin binding, proapoptotic effect presumably via PKCδ, and pro-differentiation effect as evidenced by CD11b expression. Furthermore, it was shown that the antimitotic and proapoptotic effects of bistramide A were not secondary effects of actin binding but independent effects.
The third aim in this study was to synthesize a library of a new class of urea-based type II inhibitors targeted at the kinase domain of anaplastic lymphoma kinase (ALK). The best compounds in this library showed IC50 values as low as 390 nM for ALK while the initial low cellular activities were successfully increased even by more than 70 times for NPM-ALK- positive BaF3 cells. More importantly, selective antiproliferative activity on ALK-positive cell lines was achieved; while the best compound affected the BaF3 and SU-DHL-1 cells with IC50 values of 0.5 and 0.8 μM, respectively, they were less toxic to the NPM-ALK-negative human leukemic cells U937 (IC50 = 3.2 μM) and BaF3 parental cells (IC50 = 5.4 μM). Furthermore, SAR studies of the synthesized compounds revealed functional groups and positions of the scaffold, which enhanced the enzymatic and cellular activities.Proteinkinaser är enzymer som katalyserar fosforyleringen av proteiner och tillhör den största enskilda familjen av enzymer, fosfotransferaserna. Proteinkinaserna har sin huvudsakliga uppgift i signaltransduktionen, d.v.s. de för vidare extracellulära signaler till intracellulära molekyler och ger på detta vis upphov till en cellulär respons. Till dessa hör t.ex. celltillväxten, celldifferentieringen och celldelningen. Dysfunktion av dessa cellulära mekanismer kan till exempel leda till cancer som utgör ett stort dilemma inom vården. Även om det finns ett utbud av kliniskt tillgängliga cancerläkemedel, håller ökande antal av cancerfall och motgångar, såsom resistens mot läkemedel, ständigt cancerforskningen aktiv.
Denna doktorsavhandling behandlar proteinkinaserna proteinkinas C (PKC) och anaplastisk lymfomkinas (ALK) och mera ingående utvecklingen av nya föreningar designade att binda deras respektive regulatoriska och katalytiska domäner. PKC är en intracellulär kinas som fosforylerar serin och treonin i proteiner. ALK är däremot en receptortyrosinkinas som har en förmodad extracellulär ligandbindande domän och en intracellulär katalytisk domän och som fosforylerar tyrosin i proteiner. Båda kinaserna är involverade i cancer.
Den första delen av undersökningen behandlar isoftalsyraderivat som designades att binda till den regulatoriska domänen av PKC. Ett bibliotek av föreningar syntetiserades för att undersöka de biologiska effekterna och struktur-aktivitetssambandet hos dessa föreningar. De bästa föreningarna orsakade apoptos (programmerad celldöd) i humana leukemiceller (HL-60) men inte i schweiziska 3T3-fibroblaster. Dessutom var de bästa apoptosframkallande derivaten varken cytotoxiska eller mutagena. Resultaten från bindingsaffinitetsstudier med dessa isoftalsyraderivat på PKC isoformer åskådliggjorde de viktiga funktionella grupperna på föreningarna. De bästa inhibitorkonstanterna uppmättes till 210 nM för PKCα och 530 nM för PKCδ.
Bistramid A är en bioaktiv cyklisk polyeter som kan isoleras från sjöpungar (Lissoclinum bistratum) och det har diskuterats om den binder den regulatoriska domänen hos PKC. Ursprungligen fann man att bistramid A aktiverar PKCδ medan de senaste rapporterna däremot har visat att aktin skulle vara det huvudsakliga proteinmålet. Totalsyntesen av denna naturprodukt samt två av dess strukturisomerer utfördes för att kunna klargöra och för att ytterligare kunna studera de biologiska effekterna av bistramid A. Syntesen av den centrala delen av bistramid A, som utgör en del av denna undersökning, utfördes modifierat enligt litteraturen. Resultat från biologiska aktivitetsstudier av föreningarna visade ansamling av 4n polyploida celler som den primära verkningsmekanismen och föreningarna visade liknande allmänna antiproliferativa aktiviteter. Föreningarna visade dock olika fördelningar av antimitotisk effekt förmodligen via bindningen till aktin, proapoptotisk effekt förmodligen via PKCδ, och pro-differentierings effekt som framgår av expressionen av CD11b. Resultaten visade dessutom att bistramid A:s mitoshämmande och proapoptotiska effekter inte var sekundära effekter av bindningen till aktin men oberoende effekter.
Det tredje målsättningen i denna studie var att syntetisera ett bibliotek av en ny klass av urea-baserade typ II-inhibitorer designade att binda till kinasdomänen på ALK. De bästa föreningarna i detta bibliotek gav 50 % inhibition vid koncentrationer (IC50) så låga som 390 nM för ALK medan de preliminärt låga cellulära aktiviteterna framgångsrikt ökades mer än 70 gånger för NPM-ALK-positiva BaF3-celler. Ett ännu viktigare resultat var att selektiv antiproliferativ aktivitet för ALK-positiva cellinjer kunde uppnås. De bästa föreningarna inhiberade ALK-positiva BaF3- och SU-DHL-1-celler med IC50-värden på 0,5 och 0,8 μM, respektive, medan de var mindre toxiska för NPM-ALK-negativa humana leukemiceller (IC50-värden för U937 och BaF3 var 3,2 och 5,4 μM, respektive). Dessutom visade resultaten från studierna struktur-aktivitetssambandena hos föreningarna som modulerade de enzymatiska och cellulära aktiviteterna
