Plants are rooted to their growth place; therefore it is important that they react adequately to changes in environmental conditions. Stomatal pores, which are formed of a pair of guard cells in leaf epidermis, regulate plant gas-exchange. Importantly, guard cells protect the plant from desiccation in drought conditions by reducing the aperture of the stomatal pore. They serve also as the first barrier against the major air pollutant ozone, but the behaviour of guard cells during ozone exposure has not been sufficiently addressed. Aperture of the stomatal pore is regulated by the influx and efflux of osmotically active ions via ion channels and transporters across the guard cell membrane, however the molecular identity of guard cell plasma membrane anion channel has remained unknown.
In the frame of this study, guard cell behaviour during ozone exposure was studied using the newly constructed Arabidopsis whole-rosette gas-exchange system. Ozone induced a Rapid Transient Decrease (RTD) in stomatal conductance within 10 min from the start of exposure, which was followed by a recovery in the conductance within the next 40 min. The decrease in stomatal conductance was dependent on the applied ozone concentration. Three minutes of ozone exposure was sufficient to induce RTD and further ozone application during the closure-recovery process had no effect on RTD, demonstrating that the whole process is programmed within the first three minutes. To address the molecular components responsible for RTD, the ozone response was measured in 59 different Arabidopsis mutants involved in guard cell signalling. Four of the tested mutants slac1 (originally rcd3), ost1, abi1-1 and abi2-1 lacked RTD completely.
As the ozone sensitive mutant slac1 lacked RTD, the next aim of this study was to identify and characterize SLAC1. SLAC1 was shown to be a central regulator in response to all major factors regulating guard cell aperture: CO2, light/darkness transitions, ozone, relative air humidity, ABA, NO, H2O2, and extracellular Ca2+. It encodes the first guard cell plasma membrane slow type anion channel to be identified at the molecular level. Interestingly, the rapid type anion conductance was intact in slac1 mutant plants.
For activation, SLAC1 needs to be phosphorylated. Protein kinase OST1 was shown to phosphorylate several amino acids in the N-terminal tail of SLAC1, Ser120 was one of its main targets, which led to SLAC1 activation. The lack of RTD in type 2C protein phosphatase mutants abi1-1 and abi2-1, suggests that these proteins have a regulatory role in ozoneinduced activation of the slow type anion channel.Kasvit ovat juurtuneet kasvualustaansa; tämän vuoksi on tärkeää, että ne reagoivat riittävästi ympäristön muuttuviin olosuhteisiin. Ilmaraot, jotka ovat muodostuneet huulisoluparista lehtien päällysketossa, säätelevät kasvien kaasunvaihtoa. Mikä tärkeintä, huulisolut suojelevat kasvia kuivumiselta sateettomissa olosuhteissa rajoittamalla ilmaraon avautumisastetta. Ne toimivat myös ensimmäisenä esteenä merkittävää ilmansaastetta, otsonia vastaan, mutta huulisolujen toimintaa otsonialtistuksen aikana ei ole tutkittu riittävästi. Ilmaraon avautumisastetta säätelevät osmoottisesti aktiivisten ionien sisään- ja ulosvirtaus ionikanavien kautta sekä niitä ympäröivät kuljettajaproteiinit huulisolujen kalvolla; huulisolun solukalvon anionikanavan molekyylibiologinen tausta on kuitenkin jäänyt tunnistamatta.
Tämän tutkimuksen puitteissa huulisolujen toimintaa tarkasteltiin äskettäin rakennetun laitteiston avulla, jossa lituruohon (Arabidopsis) ilmarakojen kaasujenvaihtoa voidaan seurata kokonaisesta lehtiruusukkeesta. Otsoni aikaansai nopean ja hetkellisen vähentymisen ilmarakojen johtavuudessa kymmenen minuutin aikana altistuksen alkamisesta, minkä jälkeen ilmarakojen johtavuus palautui neljässäkymmenessä minuutissa. Ilmarakojen johtavuuden vähentyminen oli riippuvainen lisätyn otsonin pitoisuudesta. Kolmen minuutin otsonialtistus oli riittävä aikaansaamaan nopean ja hetkellisen vähentymisen ilmarakojen johtavuudessa, eikä tämän jälkeen lisätty otsoni enää vaikuttanut siihen; tämä osoittaa että koko tapahtumasarja on ohjelmoitu kolmen ensimmäisen minuutin aikana. Jotta ilmarakojen johtavuuden nopean ja hetkellisen vähenemisen molekyylibiologisia osatekijöitä voisi saada selville, 59 erilaisesta lituruohomutantista, jotka liittyvät huulisolujen signalointiin, mitattiin otsonivaste. Neljältä testatuista mutanteista, nimiltään slac1 (alun perin rcd3), ost1, abi1-1 ja abi2-1, puuttui nopea ja hetkellinen ilmarakojen johtavuus täysin.
Koska otsoniherkästä slac1-mutantista puuttui nopea ja hetkellinen ilmarakojen johtavuuden vähentyminen, oli tämän tutkimuksen seuraava tavoite tunnistaa ja karakterisoida SLAC1. SLAC1 osoitettiin olevan keskeinen säätelytekijä kaikissa merkittävissä vasteissa, jotka ohjaavat huulisolujen avautumisastetta: CO2, valo-pimeä siirtymä, otsoni, ilman suhteellinen kosteus, ABA, NO, H2O2 ja solunulkoinen Ca2+. Se koodaa huulisolujen solukalvojen hidas-tyyppistä (engl. slow type ) anionikanavaproteiinia, joka on ensimmäinen osoitettu proteiini tällä molekyylibiologisella tasolla. SLAC1 tarvitsee aktivoituakseen fosforylaation. Proteiinikinaasi OST1:n osoitettiin fosforyloivan useita aminohappoja SLAC1:n N-terminaalisesta aminopäästä. Ser120 oli sen pääkohteista, mikä johti SLAC1:n aktivoitumiseen. Nopean ja hetkellisen ilmarakojen johtavuuden vähentymisen puuttuminen 2C-tyyppisten abi1-1 ja abi2-1 fosfataasimutanteissa viittaa siihen, että näillä proteiineilla on säätelytehtävä otsonin aikaansaamassa anionikanavien hidas-tyyppisessä aktivoinnissa
