The white-rot fungi Phlebia radiata and Dichomitus squalens in wood-based cultures : expression of laccases, lignin peroxidases, and oxalate decarboxylase

Abstract

Basidiomycetous white-rot fungi are the only organisms that can efficiently decompose all the components of wood. Moreover, white-rot fungi possess the ability to mineralize recalcitrant lignin polymer with their extracellular, oxidative lignin-modifying enzymes (LMEs), i.e. laccase, lignin peroxidase (LiP), manganese peroxidase (MnP), and versatile peroxidase (VP). Within one white-rot fungal species LMEs are typically present as several isozymes encoded by multiple genes. This study focused on two effi cient lignin-degrading white-rot fungal species, Phlebia radiata and Dichomitus squalens. Molecular level knowledge of the LMEs of the Finnish isolate P. radiata FBCC43 (79, ATCC 64658) was complemented with cloning and characterization of a new laccase (Pr-lac2), two new LiP-encoding genes (Pr-lip1, Pr-lip4), and Pr-lip3 gene that has been previously described only at cDNAlevel. Also, two laccase-encoding genes (Ds-lac3, Ds-lac4) of D. squalens were cloned and characterized for the first time. Phylogenetic analysis revealed close evolutionary relationships between the P. radiata LiP isozymes. Distinct protein phylogeny for both P. radiata and D. squalens laccases suggested different physiological functions for the corresponding enzymes. Supplementation of P. radiata liquid culture medium with excess Cu2+ notably increased laccase activity and good fungal growth was achieved in complex medium rich with organic nitrogen. Wood is the natural substrate of lignin-degrading white-rot fungi, supporting production of enzymes and metabolites needed for fungal growth and the breakdown of lignocellulose. In this work, emphasis was on solid-state wood or wood-containing cultures that mimic the natural growth conditions of white-rot fungi. Transcript analyses showed that wood promoted expression of all the presently known LME-encoding genes of P. radiata and laccase-encoding genes of D. squalens. Expression of the studied individual LME-encoding genes of P. radiata and D. squalens was unequal in transcript quantities and apparently time-dependent, thus suggesting the importance of several distinct LMEs within one fungal species. In addition to LMEs, white-rot fungi secrete other compounds that are important in decomposition of wood and lignin. One of these compounds is oxalic acid, which is a common metabolite of wood-rotting fungi. Fungi produce also oxalic-acid degrading enzymes of which the most widespread is oxalate decarboxylase (ODC). However, the role of ODC in fungi is still ambiguous with propositions from regulation of intra and extracellular oxalic acid levels to a function in primary growth and concomitant production of ATP. In this study, intracellular ODC activity was detected in four white-rot fungal species, and D. squalens showed the highest ODC activity upon exposure to oxalic acid. Oxalic acid was the most common organic acid secreted by the ODC-positive white-rot fungi and the only organic acid detected in wood cultures. The ODC-encoding gene Ds-odc was cloned from two strains of D. squalens showing the first characterization of an odc-gene from a white-rot polypore species. Biochemical properties of the D. squalens ODC resembled those described for other basidiomycete ODCs. However, the translated amino acid sequence of Ds-odc has a novel N-terminal primary structure with a repetitive Ala-Ser-rich region of ca 60 amino acid residues in length. Expression of the Ds-odc transcripts suggested a constitutive metabolic role for the corresponding ODC enzyme. According to the results, it is proposed that ODC may have an essential implication for the growth and basic metabolism of wood-decaying fungi.Kantasieniin kuuluvat valkolahosienet ovat ainoita organismeja, jotka hajottavat tehokkaasti puun kaikkia komponentteja. Tämän lisäksi ne pystyvät mineralisoimaan vaikeasti hajoavaa ligniinipolymeeriä solujensa ulkopuolelle erittyvien, hapettavien ligniiniä muokkaavia entsyymien avulla. Näitä entsyymejä, joista valkolahosienet tuottavat tyypillisesti useita eri geenien koodaamia isoentsyymejä, ovat lakkaasi, ligniiniperoksidaasi (LiP), mangaaniperoksidaasi (MnP) ja versatiiliperoksidaasi (VP). -- Tässä tutkimuksessa keskityttiin kahteen ligniiniä tehokkaasti hajottavaan valkolahosieneen: rusorypykkään (Phlebia radiata) ja salokääpään (Dichomitus squalens). Molekyylitason tietoa Suomesta eristetyn P. radiata FBCC43 (79, ATCC 64658) sienen ligniiniä muokkaavista entsyymeistä täydennettiin kloonaamalla ja karakterisoimalla yksi lakkaasi (Pr-lac2) ja kolme lip-geeniä (Pr-lip1, Pr-lip3, Prlip4), joista vain Pr-lip3 on aiemmin kloonattu cDNA:sta. D. squalensista kloonattiin ja karakterisoitiin ensimmäisen kerran kaksi lakkaasigeeniä (Ds-lac3, Ds-lac4). Fylogeneettinen analyysi osoitti P. radiatan LiP-isoentsyymien olevan evolutiivisesti hyvin lähellä toisiaan. P. radiatan ja D. squalensin lakkaasit ovat puolestaan kaukaista sukua toisilleen, joten ne saattavat osallistua erilaisiin fysiologisiin toimintoihin. Lakkaasiaktiivisuus nousi huomattavasti, kun P. radiatan liemiviljelmiin lisättiin ylimäärin Cu2+-ioneja. Sieni kasvoi hyvin ravinteikkaissa, runsaasti orgaanista typpeä sisältävissä liemiviljelmissä. Puu on valkolahosienten luonnollinen kasvualusta, jolla sienet tuottavat kasvuunsa ja lignoselluloosan hajottamiseen tarvittavia entsyymejä ja aineenvaihduntatuotteita. Tässä työssä valkolahosieniä kasvatettiin puulla ja puuta sisältävillä, luonnollisia kasvuolosuhteita jäljittelevillä alustoilla. Transkriptianalyysit osoittivat kaikkien P. radiatan tunnettujen ligniiniä muokkaavia entsyymien ja D. squalensin lakkaasien ilmentyvän sienten kasvaessa puulla. Yksittäisten P. radiatan lip- ja lakkaasigeenien sekä D. squalensin lakkaasigeenien transkriptimäärissä oli eroja kasvun aikana. Näiden tulosten perusteella useilla ligniiniä muokkaavilla isoentsyymeillä on tärkeä merkitys valkolahosienten kasvaessa puulla. Entsyymien lisäksi valkolahosienet erittävät puun ja ligniinin hajotukseen osallistuvia yhdisteitä, kuten oksaalihappoa, joka on puuta lahottavien sienten yleinen aineenvaihduntatuote. Sienet tuottavat myös oksaalihappoa hajottavia entsyymejä, joista yleisin on oksalaattidekarboksylaasi (ODC). ODC:n merkitystä sienissä ei toistaiseksi tunneta tarkasti. Entsyymin on ehdotettu säätelevän solunsisäistä ja -ulkoista oksaalihappopitoisuutta sekä osallistuvan ATP:n tuottoon. Tässä tutkimuksessa solunsisäistä ODC-aktiivisuutta havaittiin neljällä uudella valkolahosienikannalla. Korkein ODC-aktiivisuus mitattiin D. squalensilla kasvualustoihin tehdyn oksaalihappolisäyksen jälkeen. Oksaalihappo oli ODC:a tuottavien sienten yleisimmin erittämä ja ainoa puualustalla havaittu orgaaninen happo. Työssä kahdesta D. squalens kannasta kloonattu odc-geeni on ensimmäinen valkolahottajakäävästä kuvattu odc-geeni. D. squalensin ODC oli biokemiallisilta ominaisuuksiltaan samankaltainen muista kantasienistä kuvattujen ODC-proteiinien kanssa. Ds-odc -geenistä käännetyn aminohapposekvenssin mukaan sen koodaaman proteiinin N-terminaalissa on kuitenkin uudenlainen, noin 60 aminohapon pituinen paljon alaniinia ja seriiniä sisältävä toistojakso. Ds-odc geenin ilmentymisen perusteella sen koodaamaa entsyymiä tuotetaan konstitutiivisesti. ODC saattaakin olla tärkeä entsyymi puuta lahottavien sienten kasvulle ja perusaineenvaihdunnalle