White-rot fungi are wood degrading organisms that are able to decompose all wood polymers; lignin, cellulose and hemicellulose. Especially the selective white-rot fungi that decompose preferentially wood lignin are promising for biopulping applications. In biopulping the pretreatment of wood chips with white-rot fungi enhances the subsequent pulping step and substantially reduces the refining energy consumption in mechanical pulping. Because it is not possible to carry out biopulping in industrial scale as a closed process it has been necessary to search for new selective strains of white-rot fungi which naturally occur in Finland and cause selective white-rot of Finnish wood raw-material. In a screening of 300 fungal strains a rare polypore, Physisporinus rivulosus strain T241i isolated from a forest burn research site, was found to be a selective lignin degrader and promising for the use in biopulping.
Since selective lignin degradation is apparently essential for biopulping, knowledge on lignin-modifying enzymes and the regulation of their production by a biopulping fungus is needed. White-rot fungal enzymes that participate in lignin degradation are laccase, lignin peroxidase (LiP), manganese peroxidase (MnP), versatile peroxidase (VP) and hydrogen peroxide forming enzymes. In this study, P. rivulosus was observed to produce MnP, laccase and oxalic acid during growth on wood chips. In liquid cultures manganese and veratryl alcohol increased the production of acidic MnP isoforms detected also in wood chip cultures. Laccase production by P. rivulosus was low unless the cultures were supplemented with sawdust and charred wood, the components of natural growth environment of the fungus.
In white-rot fungi the lignin-modifying enzymes are typically present as multiple isoforms. In this study, two MnP encoding genes, mnpA and mnpB, were cloned and characterized from P. rivulosus T241i. Analysis of the N-terminal amino acid sequences of two purified MnPs and putative amino acid sequence of the two cloned mnp genes suggested that P. rivulosus possesses at least four mnp genes. The genes mnpA and mnpB markedly differ from each other by the gene length, sequence and intron-exon structure. In addition, their expression is differentially affected by the addition of manganese and veratryl alcohol. P. rivulosus produced laccase as at least two isoforms. The results of this study revealed that the production of MnP and laccase was differentially regulated in P. rivulosus, which ensures the efficient lignin degradation under a variety of environmental conditions.Valkolahosienet ovat puuta lahottavia sieniä, jotka kykenevät hajottamaan kaikkia puun polymeerejä; ligniiniä, selluloosaa ja hemiselluloosaa. Valkolahoa aiheuttavien ligniiniä hajottavien sienten käyttöä puuhakkeiden käsittelyssä ennen massanvalmistusta nimitetään biopulppaukseksi. Erityisesti ns. selektiivisiä valkolahosieniä eli sieniä, jotka hajottavat puuaineesta suhteellisesti enemmän ligniiniä kuin muita komponentteja, on pidetty lupaavina biopulppaussieninä. Koska biopulppausta ei teollisessa mittakaavassa ole mahdollista toteuttaa suljettuna prosessina, on ollut tarpeellista etsiä ja tutkia tähän tarkoitukseen soveltuvia Suomessa luonnonvaraisena esiintyviä sienikantoja. Noin 300 sienen vertailututkimuksessa erittäin harvinainen metsäpaloalueilla esiintyvä talikääpä, Physisporinus rivulosus kanta T241i, osoittautui selektiiviseksi ligniininhajottajaksi ja biopulppausominaisuuksiltaan lupaavaksi.
Ligniinin hajotukseen osallistuvia entsyymejä ovat lakkaasi, ligniiniperoksidaasi (LiP), mangaaniperoksidaasi (MnP), hybridityyppinen peroksidaasi (versatile peroxidase; VP) sekä vetyperoksidia tuottavat entsyymit. Tässä työssä P. rivulosus T241i:n havaittiin erittävän puuhakkeella kasvaessaan oksaalihappoa sekä MnP:a ja lakkaasia. Mangaani ja veratryylialkoholi edistivät liuosviljelmässä MnP:n tuottoa. Lakkaasia P. rivulosus tuotti liuosviljelmässä melko vähän, jos alustassa ei ollut sen luontaiseen kasvuympäristöön kuuluvia kiinteitä substraatteja.
Valkolahosienille on tyypillistä, että niiden ligniiniin vaikuttavat entsyymit esiintyvät lukuisina isomuotoina. P. rivulosus T241i:lta karakterisoitiin kaksi eri MnP:a koodaavaa geeniä, mnpA ja mnpB, mutta MnP:n N-terminaalisten aminohapposekvenssien analyysin perusteella on todennäköistä, että sienellä on mnpA:n ja mnpB:n lisäksi ainakin kaksi muuta mnp-geeniä. Geenit mnpA ja mnpB poikkesivat merkittävästi toisistaan sekä geenin pituuden että introni-eksoni -rakenteen suhteen. Lisäksi veratryylialkoholi ja mangaani vaikuttivat P. rivulosusin mnpA ja mnpB geenien ilmentymiseen eri tavalla. P. rivulosusista löydettiin kaksi lakkaasi-isomuotoa. Tämän tutkimuksen tulosten mukaan P. rivulosus:lla erot kasvuolosuhteissa vaikuttivat eri entsyymien eritykseen eri tavalla, mikä takaa sienen tehokkaan ligniinin hajotuksen erilaisissa kasvuolosuhteissa
