Orientadora : Drª Andréa Rodrigues ÁvilaCoorientadora: Profa.Dra. Fabíola Barbieri HoletzDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 23/02/2012Bibliografia: fla. 150-154Resumo: A regulação da expressão gênica em tripanossomatídeos ocorre principalmente em nível póstranscricional. Assim, a abundância do mRNA depende de fatores que alterem a estabilidade, localização e acesso destes mRNAs aos polissomos. Diversos estudos têm demonstrado que grânulos de mRNA, presentes em eucariotos têm papel fundamental na regulação da expressão gênica em nível pós-transcricional. Tais grânulos participam ativamente nos processos de estocagem, tradução e degradação do mRNA. Grânulos de estresse e P-bodies são tipos diferentes de grânulos de RNA, e algumas proteínas que constituem o cerne dessas estruturas, em leveduras e mamíferos, já foram identificadas em T. cruzi. Dentre elas, podemos citar a proteína DHH1, uma DEAD-box RNA helicase que estimula a degradação de mRNAs. Em T. cruzi esta proteína tem expressão constitutiva e faz parte de grânulos de RNA que estão presentes no parasita tanto em fase logarítmica de crescimento quanto nas formas submetidas a estresse nutricional, uma característica de formação semelhante aos P-bodies. Contudo, o conteúdo protéico dos grânulos que contém a proteína TcDHH1 em T. cruzi, é formado por componentes específicos de grânulos de estresse. Por isso, o foco desse estudo foi desvendar as funções de grânulos que contém DHH1 em T. cruzi e avaliar se teriam papel majoritário na estocagem, como grânulos de estresse ou no processamento e degradação de mRNAs, como P-bodies. Para isso, várias ferramentas se fizeram necessárias, desde a produção de anticorpos até a padronização de técnicas mais elaboradas. Estudos prévios em epimastigotas utilizando microarranjo de DNA identificaram mRNAs alvos da proteína TcDHH1, os quais em sua maioria representam genes estágio-específicos expressos em outros estágios do ciclo de vida do parasita. Dessa forma, para tentar desvendar se os grânulos de TcDHH1 participam da estocagem ou degradação de mRNAs, os parasitas foram tratados com drogas que inibem os processos de transcrição (actinomicina D) e de trans-splicing (sinefungina) e a estabilidade dos mRNAs alvos da TcDHH1 foi avaliada pela técnica de PCR quantitativa. Os dados obtidos em epimastigotas demonstram que a proteína TcDHH1 interage tanto com alvos estáveis (geralmente mais expressos em epimastigotas) quanto com alvos instáveis (em sua maior parte, mais expressos em outros estágios do ciclo de vida). Paralelamente, demonstramos a colocalização dos grânulos que contém a proteína TcDHH1 e os seus mRNAs alvo pela técnica de FISH, em epimastigotas. Além disso, a fim de elucidar melhor a composição dos grânulos de T. cruzi, escolhemos duas proteínas específicas de degradação de mRNAs para estudo: a exonuclease 5'-3'TcXRNA, que é regulada durante o ciclo de vida e a desadenilase TcPOP2, componente do complexo CCR4-NOT. Ambas as proteínas colocalizam parcialmente com TcDHH1 em grânulos citoplasmáticos nas formas epimastigotas, sugerindo que o destino dos mRNAs alvos desta proteína seja dependente da combinação protéica dos grânulos, corroborando a complexidade do processo de regulação da expressão gênica neste parasita.Abstract: In trypanosomatids, gene expression is regulated mainly post-transcriptionally by mechanisms involving changes in mRNA stability or access to polysomes. Recent studies have demonstrated that cytoplasmic RNA granules, present in several eukaryotes, have key role in regulation of gene expression. These granules are involved in mRNA sorting, storage and degradation and can be divided in different classes, including P-bodies and stress granules and some of the proteins that are included in the core of these structures, in yeast and mammals, have been identified in T. cruzi. The highly conserved DEAD-box helicase Dhh1p stimulates mRNA degradation. In T. cruzi, expression of DHH1 is not regulated throughout the parasite's life cycle or under stress conditions. This protein is present in polysome-independent complexes and is located to discrete cytoplasmic foci, resembling P-bodies. However, the protein content of these granules shows grater similarity to stress granules. Thus, the main focus of this study is to unravel if TcDHH1 granules have a major role on storage (similar to stress granule) or on degradation of transcripts (similar to P-bodies). In order to perform this study, several tools were necessary, from the production of antibodies to standardization of sophisticated techniques. Previous studies in epimastigotes revealed that several mRNA targets of TcDHH1, identified by ribonomic microarray and confirmed by RT-PCR, codify mainly proteins that are regulated in a stage-specific manner and expressed in other stages of life cycle. In order to determine if these TcDHH1 granules participate in storage/stabilization or degradation of mRNAs, the parasites were treated with drugs that inhibit transcription (actinomycin D) and trans-splicing (sinefungin) and the stability of target mRNAs were evaluated by quantitative PCR. The data obtained demonstrate that TcDHH1 interacts with both stable (usually upregulated in epimastigotes) and unstable (upregulated in other stages of life cycle) transcripts. In parallel, we demonstrated the colocalization between TcDHH1 granules and its target mRNAs in epimastigotes, by FISH. Furthermore, in order to better elucidate de granules' content in T. cruzi, we chose two degradation specific proteins: the 5' -3' exonuclease TcXRNA, which is regulated throughout the life cycle, and the deadenylase TcPOP2, a component of the CCR4-NOT complex. Both proteins partially colocalize with TcDHH1 in cytoplasmic granules in epimastigotes, suggesting that the destiny of these proteins' targets is dependent on the combination with other proteins in these granules and corroborating the complexity of the regulation of gene expression in these parasites
