The transfer of donor lymphocytes into patients is one way to treat persistent or relapsing malignancies after stem cell transplantation. Safety considerations suggest equipping the cells with conditional suicide switches to stop treatment when adverse effects emerge. The major aim of the present study was to establish a conditional suicide switch based on the expression of human proapoptotic proteins in the human T cell line Jurkat, using the regulatory components of the Tet system. Such an approach could overcome certain limitations posed by the most frequently used and currently clinically tested suicide system which relies on the expression of a viral thymidine kinase. Fundamental requirements for the generation of such a suicide system are i) tight expression control, ii) reliable inducibility of the switch and iii) efficient cell death induction. To achieve tight expression control, the combined activator-repressor strategy was applied to generate Jurkat regulator cell lines. Two mechanistically different acting transsilencers, tTS-KRAB and tTS-PP, harbouring either a KRAB repression domain or a PLDLS motif, were respectively coexpressed with the reverse transactivator rtTA2S-M2. Both approaches conferred excellent regulatory properties to the resulting cell lines. However, when controlling the expression of chromosomally integrated transgenes, tTS-KRAB-mediated repression was shown to silence transgene expression irreversibly, probably due to the recruitment of heterochromatin. Repression mediated by the recently developed transsilencer tTS-PP in the cell line Jr2SM2PP, in contrast, did not interfere with subsequent transactivation, even when repression was maintained for several weeks prior to induction. Because the Tet-inducible promoter can influence the quality of regulation, the performance of four different Tet-inducible promoters was analyzed in Jr2SM2PP cells. The results revealed greatly diverging characteristics concerning basal leakiness and the maximal expression levels achieved and identified TREtight as most approriate for controlling cytotoxic transgenes. Different proapoptotic proteins were tested in transient transfections for doxycycline-dependent cell death induction in Jurkat cells. Using stably integrated, insulator-flanked and TREtight-controlled suicide expression cassettes encoding the recombinant proapoptotic molecules revCasp3 and tBid, efficient suicide switches were generated in the Jurkat regulator cell line Jr2SM2PP. With both switches, up to 99% of all cells died 24 hours after induction. The approach provided stringent expression control which was monitored for several months. After that time-period in the uninduced state, cell death was induced as efficiently as before. The actual target cells of therapeutic safety switch applications are primary human T cells. Episomally persisting herpesvirus saimiri-derived vectors are a promising tool for gene transfer into that cell type. Within the scope of this thesis, different all-in-one Tet-inducible transgene expression cassettes were constructed and cloned into herpesvirus saimiri transfer vectors. They were subsequently tested for doxycycline-dependent regulation of expression in primary human cells in the research group of a collaboration partner. Additionally, the potential of different human bidirectional promoters to drive the coordinated expression of two transgenes was tested in this study. One promoter, pTFP, responsible for the transcription of the mitochondrial trifunctional protein subunits at its endogenous locus, showed promising properties. Stably integrated into HeLa cells it mediated reliable transcription of a dual regulator setup for several months.Die Transfusion von Donorlymphozyten ist eine Möglichkeit, nach erfolgter Stammzelltransplantation persistierende oder wieder aufkeimende bösartige Erkrankungen zu behandeln. Um die Sicherheit solcher Ansätze zu gewährleisten, werden die Donorzellen mit einem konditionalen Suizidschalter ausgestattet, der es erlaubt, die Behandlung beim Auftreten unerwünschter Nebenwirkungen abzubrechen. Hauptziel der vorliegenden Arbeit war die Etablierung eines konditionalen, auf der Expression humaner proapoptotischer Proteine basierenden Suizidschalters in der humanen T-Zelllinie Jurkat, unter Verwendung der regulatorischen Komponenten des Tet-Systems. Solch ein Ansatz könnte gewisse Einschränkungen überwinden, die sich bei der Anwendung des zur Zeit am häufigsten eingesetzten Suizidsystems, das auf der Expression der viralen Thymidinkinase beruht und gegenwärtig klinisch getestet wird, ergeben. Grundlegende Anforderungen an solch ein Suizidsystem sind i) strikte Expressionskontrolle, ii) die konstante Induzierbarkeit des Schalters und iii) effiziente Zelltodinduktion. Zur Gewährleistung strikter Expressionskontrolle wurde die kombinierte Aktivator-Repressor-Strategie angewandt, um Jurkat-Regulatorlinien zu generieren. Zwei mechanistisch unterschiedlich wirkende Transsilencer, tTS-KRAB and tTS-PP, die entweder die KRAB-Repressionsdomäne oder ein PLDLS-Repressionsmotif tragen, wurden jeweils zusammen mit dem reversen Transaktivator rtTA2S-M2 coexprimiert. In beiden Ansätzen wurden hervorragend regulierende Zelllinien erhalten. Bei der Expressionskontrolle chromosomal integrierter Transgene zeigte sich jedoch, dass tTS-KRAB-vermittelte Repression, wahrscheinlich durch Rekrutierung von Heterochromatin, zum Silencing der Transgenexpression führte. Repression durch den kürzlich entwickelten Transsilencer tTS-PP in der Zelllinie Jr2SM2PP dagegen beeinträchtigte die nachfolgende Transaktivierung nicht; und zwar auch dann nicht, wenn die Transgenexpression vor ihrer Induktion schon für mehrere Wochen ausgeschaltet worden war. Da der Tet-regulierbare Promotor die Qualität der Regulation beeinflussen kann, wurde das Verhalten vier verschiedener Promotoren in Jr2SM2PP Zellen analysiert. Die Ergebnisse ließen stark divergierende Eigenschaften in Bezug auf Basalexpression und maximal mögliches Expressionsniveau erkennen. TREtight wurde als am besten geeigneter Promotor für die Kontrolle zytotoxischer Transgene identifiziert. Das Potential verschiedener proapoptotischer Proteine, bei Doxycyclin-abhängiger Überexpression Zelltod auszulösen, wurde zuerst in transienten Transfektionen untersucht. Unter Verwendung stabil integrierter, Isolator-flankierter Suizidgenexpressionskassetten, die unter der Kontrolle von TREtight stehen und für die rekombinanten proapoptotischen Moleküle revCasp3 oder tBid kodieren, wurden effiziente Suizidschalter in der Jurkat-Regulatorlinie Jr2SM2PP generiert. Mit beiden Schaltern wurden bis zu 99% der Zellen innerhalb von 24 Stunden nach Induktion getötet. Mit dem hier verfolgten Ansatz wurde stringente Expressionskontrolle nicht nur erreicht, sondern auch für mehrere Monate aufrecht erhalten. Nach dieser Zeit konnte der Zelltod genauso effizient induziert werden wie vorher. Die eigentlichen Zielzellen therapeutischer Anwendungen solcher Sicherheitsschalter sind primäre humane T-Zellen. Episomal persistierende Herpesvirus saimiri-basierte Vektoren sind ein vielversprechendes Werkzeug für den Gentransfer in diesen Zelltyp. Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene all-in-one Tet-regulierbare Transgenexpressionskassetten konstruiert und in Transfervektoren für Herpesvirus saimiri eingebracht. Diese wurden anschließend von einer kooperierenden Arbeitsgruppe auf ihre Fähigkeit überprüft, Doxycyclin-abhängige Regulation von Transgenen in humanen Primärzellen zu vermitteln. Des Weiteren wurde in dieser Arbeit das Potential verschiedener humaner bidirektionaler Promotoren getestet, die simultane Expression zweier Transgene zu vermitteln. Einer der Promotoren, pTFP, der am endogenen Locus für die Transkription der Untereinheiten des mitochondrialen trifunktionalen Proteins zuständig ist, zeigte vielversprechende Eigenschaften. Stabil integriert in HeLa Zellen, vermittelte er zuverlässig die Transkription eines dualen Regulatorsetups über mehrere Monate hinweg
