Istraživanje citotoksičnih, genotoksičnih i citogenetičkih učinaka hidrokinona na ljudskim limfocitima periferne krvi u uvjetima in vitro

Abstract

This study investigated the mechanisms of hydroquinone toxicity and assessed the relationships between its cytotoxic, genotoxic, and cytogenetic effects tested at 8, 140, and 280 μg mL-1 in human peripheral blood lymphocytes exposed for 24 h. The outcomes of the treatments were evaluated using the apoptosis/necrosis assay, the alkaline comet assay, and the cytokinesis-block micronucleus (CBMN) cytome assay. The tested hydroquinone concentrations produced relatively weak cytotoxicity in resting lymphocytes, which mostly died via apoptosis. Hydroquinone’s marked genotoxic effects were detected using the alkaline comet assay. Significantly decreased values of all comet parameters compared to controls indicated specific mechanisms of hydroquinone-DNA interactions. Our results suggest that the two higher hydroquinone concentrations possibly led to cross-linking and adduct formation. Increased levels of DNA breakage measured following exposure to the lowest concentration suggested mechanisms related to oxidative stress and inhibition of topoisomerase II. At 8 μg mL-1, hydroquinone did not significantly affect MN formation. At 140 and 280 μg mL-1, it completely blocked lymphocyte division. The two latter concentrations also led to erythrocyte stabilization and prevented their lysis. At least two facts contribute to this study’s relevance: (I) this is the first study that quantifies the degree of reduction in total comet area measured in lymphocyte DNA after hydroquinone treatment, (II) it is also the first one on a lymphocyte model that adopted the “cytome” protocol in an MN assay and found that lymphocytes exposure even to low hydroquinone concentration resulted in a significant increase of nuclear bud frequency. Considering the limitations of the lymphocyte model, which does not possess intrinsic metabolic activation, in order to unequivocally prove the obtained results further studies using other appropriate cell lines are advised.Cilj ovog istraživanja bio je proučiti mehanizme toksičnosti hidrokinona i odnose između njegovih citotoksičnih, genotoksičnih i citogenetičkih učinaka na ljudskim limfocitima periferne krvi izloženima koncentracijama 8, 140 i 280 μg mL-1 tijekom 24 sata. Posljedice izlaganja testiranom spoju istražene su primjenom testa za otkrivanje stanica u apoptozi i nekrozi, komet-testa u alkalnim uvjetima i tzv. cytome inačice citohalazinom blokiranog mikronukleus-testa. Istražene koncentracije hidrokinona izazvale su relativno nisku citotoksičnost u limfocitima, koji većinom ugibaju apoptozom. Međutim, pri istim koncentracijama primjenom komet-testa uočene su značajne promjene u razinama primarnih oštećenja DNA u odnosu na kontrolu. Statistički značajno snižene vrijednosti svih parametara komet-testa u odnosu na kontrolne stanice upućuju na specifične mehanizme međudjelovanja hidrokinona i DNA. Dobiveni rezultati upućuju na mogućnost nastanka ukriženih veza u molekuli DNA (engl. cross-linking) i nastanak adukata u DNA nakon izloženosti dvjema višim koncentracijama hidrokinona, a povišene vrijednosti lomova u DNA, uočene nakon izlaganja najnižoj ispitanoj koncentraciji, upućuju na veći značaj oksidacijskih oštećenja i utjecaj mehanizama povezanih s inhibicijom enzima topoizomeraze II. Pri koncentraciji 8 μg mL-1 hidrokinon ne izaziva značajan porast broja mikronukleusa. Koncentracije 140 i 280 μg mL-1 potpuno koče diobu limfocita, a ujedno izazivaju i stabilizaciju membrana eritrocita, sprječavajuć njihovu lizu. Dva dobivena rezultata značajan su doprinos postojećim saznanjima o toksičnosti hidrokinona: (I.) Ovo je prvo istraživanje u kojem je izmjereno smanjenje ukupne površine kometa limfocitne DNA nakon izlaganja hidrokinonu; (II.) Ovo je prvo istraživanje u kojem je primijenjena cytome inačica mikronukleus-testa, kojom smo dokazali da izloženost čak i vrlo niskim koncentracijama hidrokinona dovodi do značajno povišene učestalosti nastanka jezgrinih pupova u limfocitima. Uzevši u obzir ograničenja limfocita kao modela, ponajprije nedostatak unutarnje metaboličke aktivacije, za nedvojbenu potvrdu dobivenih rezultata predlažemo nastavak istraživanja i na drugim prikladnim modelima staničnih linija