Estudo de genes de Candida albicans com função desconhecida quanto à formação de biofilme, características biológicas e interação patógeno- hospedeiro

Abstract

Candida albicans is an opportunistic fungi capable of causing superficial and systemic infections. Most of infections are mediated by biofilm formation which confers resistance to antifungal agents and immune system, but the mechanisms of biofilm development and pathogenicity were not thoroughly elucidated yet. In the presente study, 9 unknown function genes of C. albicans were selected among 34 mutant strains that presented altered phenotype for biofilm formation. The biofilms were formed on 96-well microtitle plates or on polystyrene disks and evaluated in different time intervals. Next, 4 complemented strains were constructed and evaluated for susceptibility to stressor agents, growth under nutrient limitation and filamentation tests. The biofilm architecture was analyzed by scanning electron microscopy (SEM). The biofilms were also assessed as the quantity of β-1,3-glucan and chitin. For the infection models, buccal epithelial cells (TR-146) were used for adherence, invasion and damage assays. The pathogenicity of the strains was evaluated in embrionated chicken eggs for 7 days, after inoculation of the strains. Planktonic cells and biofilms were submitted to antifungal tests with fluconazole, amphotericin B, and caspofungin. Quantitative polymerase chain reaction was performed to verify the expression of MRV8 and NDT80 genes in fungal cells in interaction with epithelial cells and MRV8, MRV1, and MRV6 genes in cells grown in biofilm. The results were submitted to the Student t test, ANOVA, Tukey's test, and Log-rank test (Mantel-Cox) (p < 0.05). Four complemented strains were constructed for the selected genes ORF19.823, ORF19.7170, ORF19.6847, and MRV8. The function of the ORF19.823 is still unknown, because the mutant strain did not show any significative phenotype for the tests performed. The mutant strain for the ORF19.7170 caused less damage on epithelial cells, but the result was not significant and the gene was dispensable...Candida albicans é um fungo oportunista capaz de causar infecções superficiais e até sistêmicas. A maioria das infecções é mediada pela formação de biofilme que confere resistência aos agentes antifúngicos e ao sistema imune, porém os mecanismos de desenvolvimento do biofilme e patogenicidade ainda não foram completamente elucidados. No presente estudo foram selecionados 9 genes de C. albicans com função desconhecida, dentre 34 cepas mutantes que apresentaram fenótipo alterado para formação de biofilme. Os biofilmes foram formados em placas de 96 poços ou discos de poliestireno e avaliados em diferentes tempos de desenvolvimento. A seguir foram construídas 4 cepas complementadas que foram avaliadas quanto à susceptibilidade a agentes estressantes, crescimento sob limitação de nutrientes e testes de filamentação. A arquitetura dos biofilmes foi analisada por microscopia eletrônica de varredura (MEV). Os biofilmes também foram avaliados quanto à quantidade de β-1,3-glucana e quitina. Para os modelos de infecção, células epiteliais bucais (TR-146) foram utilizadas para análise de aderência, invasão e dano. A patogenicidade das cepas foi avaliada em ovos embrionados de galinha durante 7 dias, após a inoculação das cepas. Células planctônicas e biofilmes foram submetidos a testes antifúngicos com os agentes fluconazol, anfotericina B e caspofungina. A reação em cadeia da polimerase quantitativa foi realizada para verificar a expressão dos genes MRV8 e NDT80 em células fúngicas em interação com células epiteliais e MRV8, MRV1 e MRV6 em células crescidas em biofilme. Os resultados foram analisados por teste t de Student, ANOVA, Tukey e testes de Log-rank (Mantel-Cox) (p < 0,05). Foram construídas 4 cepas complementadas para os genes selecionados ORF19.823, ORF19.7170, ORF19.6847 e MRV8. A função de ORF19.823 ainda permanece desconhecida, pois nãofoi observado fenótipo msignificativo para a cepa....Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES