Die Infektion und Reaktivierung des humanen Cytomegalovirus (HCMV) bei immun-supprimierten Patienten, insbesondere nach hämatopoetischen Stammzelltransplantati-onen, stellen nach wie vor ein großes Problem dar. Trotz strenger Überwachung und präventiver Therapie sind sie eine der Hauptursachen lebensbedrohlicher Komplikatio-nen. Eine adoptive Immuntherapie durch die Gabe Virus-spezifischer, aus dem Blut des Spenders isolierter und ex vivo expandierter zytotoxischer Gedächtnis-T-Zellen ist eine der neueren, vielversprechenden Therapien gegen HCMV. Dies ist bei Stammzelltrans-plantationen jedoch nur anwendbar, wenn der Spender HCMV seropositiv ist. Bei der Konstellation eines seropositiven Empfängers und eines seronegativen Spenders ist es nicht möglich Gedächtnis-T-Zellen aus dem Blut des Spenders in ausreichender Menge zu isolieren.
Eine technologische Variante der bispezifischen Antikörper, sogenannte Bispecific T cell engagers (BiTE®), sind sowohl für maligne Erkrankungen als auch für virale Infektionen eine aussichtsreiche Form der Therapie. BiTE® Moleküle erkennen auf der einen Seite ein Oberflächen-Antigen auf der Zielzelle, auf der anderen Seite das CD3 auf T-Zellen und sind dadurch in der Lage maligne oder Virus-infizierte Zellen mit zytotoxischen T-Zellen zu verbinden und Effektor-Funktionen der T-Zellen zu aktivieren. Der erste durch die FDA zugelassene BiTE® war Blinatumomab, ein CD19/CD3 spezifischer Antikörper, der erfolgreich für die Therapie Philadelphia-Chromosom negativer rezidivierter oder re-fraktärer akuter lymphatischer Prä-B-Zell Leukämie (Prä-B ALL) eingesetzt wird.
Das Glykoprotein B (gB) des HCMV, welches auf der Oberfläche infizierter Zellen ex-primiert wird, wurde bereits in früheren Arbeiten (Full et al., 2010) als Zielantigen eines chimären Antigen-Rezeptors (CAR) genutzt. Basierend auf den Ergebnissen der Cha-rakterisierung dieses CARs wurde in Kooperation mit Amgen ein spezifischer, gegen das HCMV gB gerichteter BiTE® entwickelt. Die Funktionalität der humanen Version, welche neben gB das CD3 humaner T-Zellen bindet, konnte von unseren Kooperations-partnern bereits in vitro bestätigt werden. Aufgrund der positiven Daten soll der HCMV gB-BiTE® in einem in vivo Mausmodell weiter charakterisiert werden. Da HCMV nur hu-mane Zellen infiziert, wurde von unserer Arbeitsgruppe ein MCMV generiert, welches das HCMV gB exprimiert, wobei dieses zur besseren Oberflächenpräsentation an eine EpCAM Domäne fusioniert wurde (MCMV gB-EpCAM). Außerdem stellte Amgen eine murine Version des gB-BiTE®, welcher das CD3 muriner T-Zellen erkennt, zur Verfü-gung. In dieser Arbeit sollte zunächst das Potential des murinen gB-BiTE® in vitro überprüft werden. Dies beinhaltetet zum einen die Bestimmung einer geeigneten BiTE®-Konzentration zur optimalen Aktivierung von T-Zell-Effektorfunktionen, wie Zytokinfrei-setzung und Zytotoxizität, sowie die Etablierung eines Assays zur Überprüfung einer Spezies- und Antigen-spezifischen Funktionalität und die Charakterisierung der Wirk-weise des gB-BiTE®.
Dieser vermochte es, abhängig von seiner Konzentration eine Freisetzung von IFN γ durch die T-Zellen zu induzieren und dadurch eine verminderte Virusausbreitung zu vermitteln. Trotz der starken Aktivierung der zytotoxischen T-Zellen waren MCMV-infizierte Fibroblasten, ebenso wie HCMV infizierte Fibroblasten, jedoch resistent ge-genüber einer T-Zell-vermittelten Lyse. Die durch den gB-BiTE® vermittelte Inhibition der viralen Ausbreitung scheint außerdem noch von weiteren, spezifisch gegen gB-exprimierende Zellen gerichteten Mechanismen beeinflusst zu werden.
Aufgrund der geringen Halbwertszeit kanonischer BiTE® Moleküle wurde, nach erfolg-reicher Bestätigung der Funktionalität des gB-BiTE®, für die Anwendung im Mausmodell eine Halbwertszeit-verlängerte Version (HWZv BiTE®) von Amgen generiert und diese hier analog zur normalen Variante charakterisiert. Der HWZv BiTE® verhielt sich dabei identisch zu seinem Vorgänger, bis auf eine, vermutlich durch den viralen Fcγ-Rezeptor (vFcγR) vermittelte Antigen-unspezifische Bindung an MCMV Wt infizierten Zellen. Er vermittelte die Aktivierung der T-Zellen und durch die damit verbundene Sekretion von IFN γ eine Inhibition der Infektionsausbreitung, jedoch ebenfalls keine Lyse der infizier-ten Zielzellen durch zytotoxische T-Zellen.
Die Inkubation MCMV Wt infizierter Zellen mit rekombinantem IFN γ sowie die Kombina-tion von IFN γ und TNF α, führte zu einer stark inhibierten viralen Ausbreitung und stützt die Aussage einer antiviralen Wirkung des gB-BiTE® durch die Vermittlung spezifischer Zytokin-Sekretion. TNF α alleine bewirkte jedoch einen bisher unbeschriebenen gegen-teiligen Effekt, nämlich eine deutlich gesteigerte Ausbreitung der Viren.
Zusammengefasst bestätigt die vorliegende Arbeit die Funktionalität sowohl des norma-len murinen gB-BiTE® als auch einer Halbwertszeit-verlängerten Variante in vitro im murinen System und zeigt, dass diese für die weitere Evaluation in einem in vivo Maus-modell mit MCMV geeignet sind.Infection and reactivation of the human cytomegalovirus (HCMV) in immunocompro-mised patients, in particular after hematopoietic stem cell transplantation and despite strict controls and pre-emptive therapy, remain major causes of life threatening condi-tions in patients. Adoptive immunotherapy with virus-specific cytotoxic memory T cells isolated from the donor’s blood and ex vivo expanded is a promising experimental ther-apy against HCMV. Unfortunately this approach is only feasible with a seropositive do-nor. In the high-risk constellation of a seronegative donor and a seropositive patient it is not possible to isolate enough HCMV specific memory T cells from the donor’s blood.
A technological variant of bispecific antibodies, the so-called Bispecific T cell engagers (BiTE®), represent a promising therapy form for malignant diseases as well as virus in-fections. BiTE® molecules are able to recognize two molecules at the same time – a sur-face antigens expressed on target cells and the CD3 on T cells. This enables them to bring malignant or virus infected cells in close proximity to cytotoxic T cells, and acti-vates the T cell effector functions. The first BiTE® which got FDA approval was Blina-tumomab, a CD19/CD3 specific antibody for remitting or refractory Ph-Pre-B cell Acute Lymphoblastic Leukaemia (Pre-B ALL).
The HCMV glycoprotein g (gB), which is expressed on the surface of infected cells, was already used in prior works (Full et al., 2010) as an antigen for an HCMV specific chi-meric antigen receptor (CAR). Based on the results of the characterisation of this CAR, a specific BiTE® targeting the HCMV gB was developed in cooperation with Amgen. The function of the human gB-BiTE® version, which targets the gB and connects it to the human CD3, could already be verified in vitro by our cooperation partners. As a result of these positive data, the gB-BiTE® needed further characterisation in an in vivo mouse model. Since HCMV only infects human cells, our group designed an MCMV additionally expressing the HCMV gB, which for better surface presentation is fused to the EpCAM domain (MCMV gB-EpCAM). Moreover Amgen provided a murine version of the gB-BiTE®, which is able to bind to CD3 on murine T cells.
In the present work the potential of this murine gB-BiTE® was investigated in vitro. This included the determination of a suitable BiTE® concentration, in order to trigger optimal T cell effector functions like cytokine secretion and cytotoxicity, as well as establishing an assay to test for a species- and antigen-specific functionality and the mode of action of the gB-BiTE®. Depending on its concentration, the gB-BiTE® triggered the release of IFN γ by T cells and thereby decreased viral spread. Despite a strong activation of cytotoxic T cells, MCMV-infected cells still remain resistant to T cell mediated lysis. The gB-BiTE® medi-ated inhibition of the viral dissemination, in addition to secreted cytokines, seems to de-pend on further mechanisms specific for gB-expressing cells.
After successful confirmation of the functionality of the gB-BiTE®, and due to the short serum half-life of the BiTE® molecules, a half-life extended BiTE® (HLE BiTE®) was gen-erated by Amgen to facilitate the application in a mouse model. It was characterised analogous to the normal gB-BiTE®. Aside from an antigen-unspecific binding of the HLE BiTE® to MCMV Wt infected cells, it acts similar as its predecessor. The observed un-specific activation might be due to the expression of cytomegaloviral Fcγ receptors (vFcγR), which are able to bind to Fc domains of immunoglobulins. The HLE gB-BiTE® mediates the activation of T cells and thereby secretion of IFN γ, which results in inhibi-tion of the viral spread. However, direct lysis of the infected target cells was not ob-tained.
The incubation of MCMV Wt infected cells with recombinant IFN γ, as well as a combi-nation of IFN γ and TNF α, reduces virus dissemination and supports the conclusion that an anti-viral effect of the gB-BiTE® is mediated by cytokine secretion. Notably, TNF α alone produced an unexpected and previously unknown effect, as it resulted an in-creased viral spread.
In summery the present data shows both the normal murine gB-BiTE® and the half-life prolonged version of the BiTE® are functional in vitro in a murine system, permitting now the application in an in vivo mouse model
