1A.1 Einleitung Die Therapie septischer Patienten stellt für den Kliniker nach wie vor eine Herausforderung dar. Neben der kausalen Therapie mit Antibiotika gibt es vielversprechende Ansätze mit verschiedenen Anabolika, wie Insulin und ß-Blockern, die sich in der klinischen Erprobung befinden. Über die Wirkmechanismen dieser anabolen Substanzen auf das Immunsystem auf zellulärer und molekularer Ebene ist bisher noch wenig bekannt. Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, die Effekte von Insulin und Propranolol auf das Zellüberleben, die Zellaktivität, die Apoptose und die proinflammatorische Antwort in humanen Makrophagen zu bestimmen, die mit Lipopolysaccharid (LPS) stimuliert wurden. 1A.2 Material und Methoden Humane Makrophagen (THP-1) wurden mit LPS stimuliert und anschließend mit Insulin oder Propranolol behandelt. Zudem wurde eine Negativkontrolle unter alleiniger Gabe von Kulturmedium durchgeführt. Die Zellvitalität wurde anhand der Trypanblaufärbung ermittelt. Um die Zellaktivität zu ermitteln, wurde der Zellproliferationsassay (MTS) verwendet. Die Apoptoserate wurde mittels JC-1 Färbung sowie der TUNEL Färbung detektiert. Um festzustellen, ob die Effekte des Insulins über den PI3-K Signalweg vermittelt werden, wurde der PI3-K Inhibitor Wortmannin verwendet. Da bei der Apoptose auch der NF-kB Signalweg eine zentrale Rolle spielt, wurde der NF-kB Blocker TPCK verwendet, um die Effekte von Insulin und Propranolol auf zellulärer Ebene zu untersuchen. Die TNFa und IL-1ß Konzentrationen wurden in den Zellkulturüberständen gemessen, um die Effekte von Insulin und Propranolol auf die Expression proinflammatorischer Zytokine zu untersuchen. 1A.3 Ergebnisse Die wichtigsten Ergebnisse werden im Folgenden zusammengefasst: 1. LPS reduzierte die Zellvitalität in THP-1 Zellen dosisabhängig. Dieser Effekt konnte durch Gabe von Insulin oder Propranolol aufgehoben werden. Ideal erscheinen hier Dosen von 5U/ml Insulin bzw. 10µM Propranolol. 2. LPS reduzierte die Zellaktivität dosisabhängig. Die Behandlung der LPS stimulierten THP-1 Zellen mit Insulin bzw. Propranolol zeigte keine relevante Änderung der Zellaktivität. 3. LPS induzierte dosisabhängig Apoptose in THP-1 Zellen. Insulin und Propranolol wirkten in Kombination mit LPS antiapoptotisch. Unter Verwendung des PI3-K Inhibitors Wortmannin konnte in der vorliegenden Arbeit eine Vermittlung der zytoprotektiven und antiapoptotischen Effekte von Insulin über den PI3-K Signalweg nachgewiesen werden. Für die Wirkungen von Propranolol scheint der NF-kB Signalweg mitverantwortlich zu sein. Dies konnte mit Hilfe des NF-kB Inhibitors TPCK nachgewiesen werden. 4. LPS erhöhte die Ausschüttung der proinflammatorischen Zytokine IL-1ß und TNFa in THP-1 Zellen. Die Ausschüttung von IL-1ß in endotoxämischen THP-1 Zellen konnte durch die Gabe von Insulin zu Beginn der Inflammation signifikant gemindert werden. Die Gabe von Propranolol zeigte auf die IL-1ß Sekretion keinen signifikanten antiinflammatorischen Effekt. Die Ausschüttung von TNFa in endotoxämischen THP-1 Zellen konnte durch die Applikation von Insulin signifikant gemindert werden. Die Ausschüttung von TNFa konnte in der späten Inflammationsreaktion durch Applikation von Propranolol signifikant gemindert werden. 1A.4 Praktische Schlussfolgerung Die hier erarbeiteten Ergebnisse bieten insbesondere hinsichtlich der antiapoptotischen und zytoprotektiven Wirkungsmechanismen von Insulin und Propranolol einen erheblichen Erkenntnisgewinn. Es besteht allerdings noch erheblicher Forschungsbedarf, um diese Effekte vollständig zu verstehen. Inwiefern sich diese Erkenntnisse auf den klinischen Alltag und insbesondere auf die Therapie septischer Patienten übertragen lässt, muss anhand weiterer klinischer Studien belegt werden.1B.1 Introduction Insulin decreases the incidence of sepsis and improves mortality of critically ill patients. In endotoxemic as well as in thermally injured rats, insulin attenuates the systemic inflammatory response by decreasing the proinflammatory and increasing the antiinflammatory cascade. The aim of the present study was to determine the effects of insulin and propranolol on cell survival, cell activity, apoptosis, and proinflammatory response in a human macrophage-like cell line (THP-1 cells) stressed with lipopolysaccharide (LPS). 1B.2 Materials and methods Human macrophages were stressed with LPS and received either saline, insulin or propranolol. Cell viability was analyzed by MTS, apoptosis was detected using JC-1 and terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated nick end labelingstaining. To elucidate on the insulin signaling pathway, wortmannin was used as a phosphatidylinositol-3-kinase inhibitor. To elucidate on the propranolol signaling pathway N-p-tosyl-L-phenylalaninchloromethylketon was used as a NF-kB inhibitor. Tumor necrosis factor (TNF) and interleukin-1beta (IL-1ß) were measured to determine the effect of insulin and propranolol on proinflammatory cytokine expression. 1B.3 Results The main results are displayed in the following: 1. LPS reduced the overall cell viability in THP-1 macrophage cell line. This effect could be completely abolished by the addition of insulin or propranolol. Ideal seemed to be the use of doses of 5U/ml insulin respectively 10µM propranolol. 2. LPS reduced the cell activity in a dose-dependent-manner. The treatment of endotoxemic THP-1 macrophages showed no effect on cell activity, when doses of 5U/ml insulin respectively 10µM propranolol were administered. 3. LPS induced apoptosis in THP-1 macrophages. Insulin and propranolol blocked these proapoptotic effects. Ideal seemed to be the use of doses of 5U/ml insulin respectively 10µM propranolol. Using the PI3-K inhibitor wortmannin we could show that the cytoprotective and antiapoptotic effects of insulin were partly mediated through the PI3-K signaling pathway. Considering the effects of propranolol, the NF-kB signaling pathway might play a crucial role. This could be demonstrated using the NF-kB inhibitor TPCK. 4. LPS increased the expression of the proinflammatory cytokines IL-1ß and TNFa in the cell culture supernatants after 4, 8, 12, 24 hours. The addition of insulin at early time points (4, 8 hrs) significantly attenuated the expression of IL-1ß. The addition of propranolol did not show any significant antiinflammatory effect on the IL-1ß expression. The release of TNFa in endotoxemic THP-1 macrophages was significantly decreased by 15U/ml insulin. The release of TNFa could be significantly decreased by the addition of 1 or 10µM propranolol especially at later time points (12, 24 hrs). 1B.4 Conclusions The acquired results indicate that insulin and propranolol exert antiapoptotic effects and reduce the expression of proinflammatory cytokines in endotoxemic human macrophages. The antiapoptotic effects are mediated via the phospatidylinositol-3-kinasepathway and the NF-kB pathway
