Die Substanzklasse der Sulfoquinovosyldiacylglyceride (SQDG) stellt eine Gruppe potentiell antiviraler Wirkstoffe aus phototrophen Mikroorganismen dar, an dessen Beispiel in der vorliegenden Arbeit eine erfolgreiche Strategie der Entwicklung von entsprechenden Wirkstoffkandidaten aufgezeigt wird. Ausgehend von Literaturdaten sind potentielle SQDG-bildende Stämme aus den Algenabteilungen Rhodophyta (Porphyridium purpureum), Heterokontophyta (Heterosigma carterae, verschiedene Spezies Phaeodactylum tricorntum), Chlorophyta (Chlorella kessleri, Chlorella salina, Chlorella vulgaris) und Cyanophyta (verschiedene Spezies Arthrospira platensis, Scytonema hofmanni, Nostoc punctiforme) selektiert und zur Biomassegewinnung in 1 l Photobioreaktor-Screening-Modulen kultiviert worden. P. purpureum kann in den Untersuchungen bereits frühzeitig als SQDG-Produzent identifiziert werden. Die Biomasse der Alge bzw. der daraus gewonnene Extrakt wird daher zur Etablierung der Trennverfahren für die Gewinnung von SQDG und deren Strukturcharakterisierung mit matrix assisted laser desorption ionization (MALDI) trap time of flight (ToF) Hybrid MSn Massenspektrometrie eingesetzt. Als Aufreinigungsmethoden der SQDG eignen sich die Dünnschichtchromatographie (DC) als auch ein Adsorptions/ Desorptions-Trennverfahren mit aminopropylmodifiziertem Kieselgel. Im Rahmen von MALDI-MSn-Experimenten können die vorkommenden SQDG von P. purpureum in ihrer Struktur identifiziert werden. Die SQDG-Molekülionen werden im MS1 und die am Glycerol veresterten Acylreste C16:0, C18:2, C20:4 und C20:5 im MS2 bestimmt. Ein zusätzlicher enzymatischer Verdau der SQDG mit der regioselektiven Lipase aus Rhizopus arrhizus resultiert in der Hydrolyse der sn-1-veresterten ungesättigten Fettsäuren. Ableitend daraus kann die massenspektrometrische Eliminierung der ungesättigten Fettsäuren an dieser Position (MS2) geklärt werden. Die Sulfoquinovose als charakteristisches Strukturelement wird im MS3-Experiment bestätigt. Die MALDI-Untersuchungen identifizieren zudem SQDG in den Mikroalgen H. carterae und den Spezies von P. tricorntum sowie den Cyanobakterien S. hofmanii, N. punctiforme und einem Spezies von A. platensis. Die SQDG aus den Mikroalgen variieren in der sn-1-veresterten ungesättigten Fettsäure. An sn-2-Position der SQDG ist in den Mikroalgen ein Palmitoylrest lokalisiert, der einen prokaryotischen Biosyntheseweg der SQDG in eukaryotischen Mikroorganismen kennzeichnet. Die SQDG-produzierenden Cyanobakterien A. platensis und N. punctiforme können SQDG sowohl prokaryotisch als auch eukaryotisch (C18-Fettsäure an sn-2-Position) synthetisieren. Zusätzlich zu den SQDG kann in den selektierten P. tricornutum-Stämmen die Bildung von acylierten Sulfoquinovosyldiacylglyceriden (Ac-SQDG) mit der MALDI ToF Analytik nachgewiesen werden. Die Ac-SQDG besitzen im Gegensatz zu den SQDG an der 2´-Position der Sulfoquinovose eine zusätzlich veresterte Fettsäure. Zur Untersuchung der antiviralen Aktivität der SQDG ist aufgrund der sehr hohen klinischen Relevanz das humane Cytomegalievirus (HCMV) als Targetvirus ausgewählt und eine Immunoperoxidasefärbung (POX) im zellkulturbasierten Assay mit MRC-5-Fibroblasten etabliert worden. Dabei wird die Viruslast über die Detektion der viralen Immediate Early (IE) Proteine ermittelt. IE-Proteine werden direkt nach dem Eindringen des Virus in die Wirtszelle gebildet. Eine Reduktion der detektierten viralen IE-Proteine in den MRC-5-Zellen lässt damit auf eine Inhibierung der Virusreplikation zu einem frühen Zeitpunkt (Adsorption, Fusion) schließen. Für die Reduktion der HCMV-Replikation um 50 % (IC50) kann nach Inkubationen von isolierten SQDG aus verschiedenen phototrophen Mikroorganismen mittels IE-POX-Assay ein Konzentrationsbereich von 33 bis 93 µg ml-1 bestimmt werden. Die SQDG-Fraktion von S. hofmanii (SQDG C18:2/C16:0) zeigt mit einer ermittelten IC50 von 19 µg ml-1eine höhere antivirale Aktivität. Dieser Wert unterscheidet sich damit im Vergleich zur Referenzsubstanz Dextransulfat (IC50 1,6 µg ml-1) um eine Größenordnung. Die Inhibierung der HCMV-Viruslast kann zudem für die isolierten Ac-SQDG-Fraktionen nachgewiesen werden. Untersuchungen zur Optimierung der SQDG-Produktion sind am Beispiel von A. platensis unter Variation der Prozessparameter Bestrahlungsstärke (30, 60, 80, 110, 140 µE m-2 s-1) und Phosphatquelle im Medium durchgeführt worden. Die maximale Raum-Zeit-Ausbeute (RZA) von 0,16 mgSQDG l-1 d-1 resultiert bei einer Kultivierung mit 110 µE m-2 s-1. Durch Sublimation von K2HPO4 durch K2P2O7 im Medium bei entsprechenden Kultivierungsbedingungen kann die RZA um 20 % gesteigert werden.Sulfoquinovosyldiacylglycerides (SQDG) represent a class of potential antiviral agents from phototrophic microorganisms which are used in order to demonstrate a successful strategy for the development of drug candidates. Based on literature studies, potential SQDG-producing strains have been selected from different alga phyla like Rhodophyta (Porphyridium purpureum), Heterokontophyta (Heterosigma carterae, different species of Phaeodactylum tricorntum), Chlorophyta (Chlorella kessleri, Chlorella salina, Chlorella vulgaris) and Cyanophyta (several species of Arthrospira platensis, Scytonema hofmanni, Nostoc punctiforme). The algae have been cultivated for biomass production in 1 l Photobioreactor-Screening-Modules. P. purpureum has been identified as a SQDG-producer during an early stage of the analyses. Therefore the biomass of the alga or rather the obtained extract were used to establish a separation processes in order to purify SQDG and to perform structural characterization using matrix assisted laser desorption ionization (MALDI) trap time of flight (ToF) hybrid MSn mass spectrometry. Appropriate purification methods for SQDG are thin-layer chromatography (TLC) as well as an Adsorption/Desorption separation method with aminopropyl modified silica gel. SQDG-constitutions from P. purpureum has been characterized by MALDI MSn-experiments, whereas MS1 experiments point out the molecular weight. Esterified acyl groups C16:0, C18:2, C20:4 und C20:5 are identified by MS2. Additional enzymatic digestion of SQDG with regio-selective Lipase from Rhizopus arrhizus results in hydrolysis of sn-1-esterified unsaturated fatty acids. Based on this fact, mass spectrometric elimination of unsaturated fatty acids at this position (MS2) can be elucidated. Sulfoquinovose as a characteristic structure element of SQDG is confirmed by MS3-experiments. Using MALDI MSn analyses SQDG could also be identify in extracts of the microalgae H. carterae and in the species of P. tricorntum as well as in the cyanobacteria S. hofmanii, N. punctiforme and one species of A. platensis. SQDG from microalgae vary in their sn-1-esterified unsaturated fatty acid. At sn-2-position of SQDG a palmitoyl residue is localized which marks a prokaryotic biosynthesis path of SQDG in eukaryotic microorganisms. SQDG-producing cyanobacteria A. platensis and N. punctiforme synthesize SQDG via prokaryotic as well as eukaryotic pathway (C18 fatty acid at sn-2-position). In addition to SQDG, the production of acylated sulfoquinovosyldiacylglycerides (Ac-SQDG) can be identified in selected strains of P. tricornutum by MALDI ToF analysis. Contrary to SQDG, Ac-SQDG have an additional esterified fatty acid at 2´-position of sulfoquinovose. The human herpes virus Cytomegalovirus (HCMV) was focussed as target virus concerning antiviral investigations. In order to analyze anti-HCMV activities of SQDGs, a virus-specific in vitro assay based on the inhibition of early steps of infection was established. Thereby, the viral load is determined by detection of viral Immediate Early (IE) proteins. IE proteins are produced in the MRC-5 host cells directly after HCM-virus penetration. The reduction of viral IE-proteins in host cells records an inhibition of an early step of viral replication (viral adsorption/fusion). By using the IE-POX-Assay the incubations of isolated SQDG from various phototrophic microorganisms results in a reduction of HCMV replication of 50 % (IC50) within the used SQDG-concentration range of 33 bis 93 µg ml-1. SQDG fraction of S. hofmanii (SQDG C18:2/C16:0) shows a higher antiviral activity, as a IC50 of 19 µg ml-1 is determined. This value varies just in one order of magnitude compared to reference agent dextransulfate (IC50 1,6 µg ml-1). Beside antiviral activity of SQDG, the inhibition of virus load can also be determined for isolated Ac-SQDG fractions. Optimization studies of SQDG-production have been performed by variation of irradiance (30, 60, 80, 110, 140 µE m-2s-1) and phosphate source in medium, taking A. platensis as an model organism. The maximum space-time yield (STY) of 0.16 mgSQDG l-1 d-1 can be achieved by a cultivation with an irradiance of 110 µE m-2s-1. Furthermore STY can be increased by 20 % at appropriate cultivation conditions by sublimation of K2HPO4 in the medium by K2P2O7
