Hintergrund und Ziele: Der Wnt-Signalweg spielt eine Rolle bei der Kontrolle der Zellproliferation und Differenzierung in vielen Geweben, einschließlich des Hormonsystems. Dieser Signalweg wurde auch in verschiedenen Tumorarten nachgewiesen. Allerdings ist nur wenig über die Wnt-Signalkaskade in Hypophysenzellen und bei der Tumorgenese bekannt. Diese arbeit diente dazu die stellung und die regulation des Wnt/β-catenin Signalweg in hypophyseal adenomen aufzuklären. Methoden: Um die Rolle des Wnt/β-catenin Signalweg in Hypophysenadenomen zu untersuchen, wurde die Expression der folgenden Proteine analysiert: β-Catenin, TCF-4 und Cyclin D1 in GH absondernden-, Null-zell- und ACTH absondernden Hypophysenadenomen. Effekte von CRH und SRIF auf des Wnt/β-catenin Signalweg wurden in AtT-20 zellen und GH-3 zellen. Für mRNA- expression rtPCR, für Protein-expression Westernblotten, für zelluläre lokalisation immunocytochemie, für β-Catenin/TCF-4 complex bildung immunoprecipitation wurden verwendet. Darüberhinaus wurde die zell proliferation mittels eines MTT Assay gemessen. Ergebnisse und Beobachtungen: Die Expression aller drei Proteine variierte stark innerhalb der Gruppen, allerdings war die durchschnittliche Konzentration in Hypophysenadenomen höher als in normalem Gewebe. Die Transfektion von primären Kulturen von GH (growth hormone) absondernder Hypophysenadenome mit dnTCF-4, welcher den Wnt/β-catenin Signalweg auf Transkriptionsebene blockiert, führte zu einer verminderten Zellproliferation. Weiterhin wurde in ACTH absondernden Hypophysenadenomen gezeigt, dass der Wnt/β-Catenin Signalweg im Vergleich zu normalem Hypophysengewebe hoch reguliert wurde. All diese Ergebnisse sprechen für die Hypothese, dass dieser Signalweg bei der Tumorbildung von Hypophysenadenomen beteiligt ist. CRH fördert physiologisch verschiedene Zellfunktionen, während SRIF diese in gleichem Maße physiologisch hemmt. Beide üben ihre jeweiligen Effekte durch Aktivierung und Hemmung der cAMP Bildung aus. In dieser Arbeit wurden deshalb sowohl der fördernde Effekt von CRH als auch der hemmende Effekt von SRIF auf den Wnt/β-catenin Signalweg von lactosomatotrophen GH3 Zellen aus Ratten untersucht. Weder CRH noch SRIF hatten Einfluss auf den Signalweg in der untersuchten Zelllinie. In corticotrophen Mäuse Hypophsenzellen (AtT-20 Zellen) CRH und Forskolin, welche die cAMP Bildung stimulieren, aktivierten auch den Wnt/β-catenin Signalweg. Beide Signalwege, cAMP/PKA und Wnt/β-catenin, haben eine gemeinsame „Schnittstelle“ im Protein GSK-3β, welches durch Forskolin an Ser9 schnell phosphoriliert und dadurch inaktiviert. Dies wiederum führt zu einer verminderten Phosphorilierung von β-Catenin. Im Gegensatz dazu verursachte SRIF, das die cAMP-Bildung hemmt, eine geringere Signalübertragung durch den Wnt/β-catenin Signalweg sowohl im Grundzustand als auch nach Forskolin-Stimulation durch eine Verminderung der Phosphorylierung von GSK-3β an Ser9. Eine Behandlung mit Forskolin erhöhte die Akkumulation von β-Catenin im Cytosol und im Kern wohingegen SRIF den gegenteiligen Effekt bewirkt. Diese Ergebnisse unterstützen die erhaltenen Daten für Cyclin D1: CRH fördert, SRIF hemmt die Menge dieses Proteins. CRH und Forskolin erhöhen die Proliferation von AtT-20 Zellen wohingegen SRIF diese vermindert. Dies könnte von ihrem Einfluss auf die Wnt/β-Catenin/TCF-4 Kaskade herrühren, da CRH, Forskolin und SRIF ihr Zielgen Cyclin D1 modulieren. Cyclin D1 wiederum kontrolliert den Ablauf des Zellzyklus und der Zellproliferation. Die Transfektion mit dnTCF-4 reduzierte signifikant die Expression von Cyclin D1 auf mRNA- und Protein Ebene, ebenso wie die Proliferation von AtT-20 Zellen, was auf einen physiologischen Einfluss des β-Catenin/TCF-4 Komplexes auf die Kontrolle der corticotrophen Proliferation schließen läßt. Schlussfolgerung: Zusammenfassend zeigen diese Daten die wichtige Rolle des Wnt/β-Catenin Signalwegs für die Kontrolle der Proliferation von somatotrophen und corticotrophen Hypophysenzellen. Weiterhin wird in dieser Arbeit ein neuer molekularer Mechanismus für die Steuerung des Wnt/β-Catenin Signalwegs durch CRH und SRIF in AtT-20 Zellen beschrieben. In GH3 Zellen wurde keine Verbindung der beiden Signalwege festgestellt.Back ground and objectives: The Wnt signaling pathway is involved in the control of cellular proliferation and differentiation in various tissues including the endocrine system. Its role has been established in different tumors, too. Little, however, is known about this cascade in pituitary cells and their role in tumorigenesis. This study was aimed to investigate the status of Wnt/β-catenin pathway in pituitary adenomas and its regulation. Methods: In order to establish the status of Wnt/β-catenin pathway in pituitary adenomas, we investigated the expression of the key players in Wnt/β-catenin pathway, including β-catenin, TCF-4 and cyclin D1 in ACTH-secreting, GH-secreting and non-functioning pituitary adenomas. Effects of CRH and SRIF on the Wnt/β-catenin pathway were studied in AtT-20 cells and GH-3 cells. For analysis of mRNA expression, reverse transcriptase polymerized chain reaction (rtPCR) and for protein expression western blotting was performed. Moreover, for cellular localization of β-catenin immunocytochemistry and for β-catenin/TCF-4 complex formation analysis immunoprecipitation was performed. Cellular proliferation was measured by MTT proliferation assay. Results and observations: A heterogeneous expression of β-catenin, TCF-4 and cyclin D1 factors was present but overall the average concentration was higher in adenomas than in normal pituitary tissue. Transfection of primary cultures from GH-secreting pituitary adenomas with dnTCF-4, blocking the Wnt/β-catenin pathway at transcriptional level, reduced the cellular proliferation. Furthermore, upregulation of the Wnt/β-catenin pathway was demonstrated in ACTH-secreting pituitary adenomas as compared to normal pituitary tissue. All these findings are compatible with the hypothesis, that this pathway is involved in the tumorigenesis of GH-secreting, non-functioning and ACTH-secreting pituitary adenomas. Corticotrophin releasing hormone (CRH) is the physiological stimulator, and somatostatin (SRIF) is the physiological inhibitor of various cellular activities. Both exert their stimulatory and inhibitory effects, respectively, through activation and inhibition of cAMP formation. In this study I investigated the role of CRH on stimulation and SRIF on inhibition of the Wnt/β-catenin pathway in rat lactosomatotroph GH3 cells. No significant effects of CRH and SRIF on the pathway in this cell line were demonstrated. After this, the effect of CRH and SRIF on Wnt/β-catenin was investigated in mouse pituitary AtT-20 corticotroph cells. CRH and forskolin, which stimulate cAMP formation, stimulated the Wnt/β-catenin signaling pathway. Cross-signaling between the cAMP/PKA and the Wnt/β-catenin pathways occurred at GSK-3β, which was rapidly phosphorylated by forskolin at Ser9 thereby causing its inactivation and resulting in decreased phosphorylation of β-catenin. In contrast, SRIF which inhibits cAMP formation, caused attenuation of basal and forskolin stimulated Wnt/β-catenin signaling. This also involved GSK-3β since SRIF treatment reduced phosphorylation of GSK-3β at Ser9. Treatment with forskolin also increased whereas SRIF decreased the cytoplasmic and nuclear accumulation of β-catenin. These findings are compatible with the increase under CRH and decrease under SRIF treatment of cyclin D1. CRH and forskolin enhanced AtT-20 cell proliferation while it was reduced by SRIF. This might result from their action on the Wnt/β-catenin/TCF-4 cascade, since CRH, forskolin and SRIF modulated its target gene cyclin D1. Cyclin D1 controls cell cycle progression and proliferation. Transfection with dnTCF-4 significantly reduced both, cyclin D1 expression at mRNA and protein level as well as cellular proliferation of AtT-20 cells, suggesting a physiological role of β-catenin/TCF-4 complex for the control of corticotroph proliferation. Conclusion: These data demonstrate an important role of the Wnt/β-catenin signaling pathway in the proliferative control of pituitary somatotrophs and corticotrophs. Also in this study a novel molecular mechanism for the change of momentum of the Wnt/β-catenin pathway by CRH and SRIF in AtT-20 cells is described. In GH3 cells, no relation was found with regards to the two pathways
