Die Umwandlung von Knorpel in Knochengewebe bei der Skelettentwicklung – die enchondrale Ossifizierung – ist ein komplexer Vorgang, dessen Verständnis auch für pathologische Vorgänge, wie Wachstumsstörungen, Skelettdysplasien und Osteoarthrose von Bedeutung ist. Bei diesem Vorgang spielt insbesondere die Differenzierung von Knorpelzellen – Chondrozyten – eine wichtige Rolle. Die Stadien der Chondrozytenreifung können durch Gene charakterisiert werden, die differentiell in den einzelnen Reifungszonen wie Ruhezone, Proliferationszone und hypertopher Zone exprimiert sind. Der Schwerpunkt dieser Arbeit versteht sich in der Analyse von zwei differentiell exprimierten Genen, TSG und Ucma in der Knorpelentwicklung. Im ersten Teil dieser Arbeit werden Versuche zur Aufklärung der Expression und Funktion von Twisted Gastrulation (TSG) einem bekannten Regulator des BMP (bone morphogenetic protein) Signaltransduktionswegs beschrieben. TSG wird während der Chondrozytendifferenzierung vermehrt in hypertrophen Chondrozyten, aber auch in der Ruhezone exprimiert (54). In in vitro Experimenten mit der chondrogenen MC615 Zelllinie (43) und isolierten primären Rippenchondrozyten fungierte TSG als BMP Antagonist hinsichtlich der Induktion der Expression von Kollagen II (Col2a1) und Kollagen X (Col10a1) RNA sowie der Phosphorylierung der BMP-abhängigen Smads (1,5,8). Die knorpelspezifische Überexpression von TSG unter dem Col2a1 Promotor zeigte eine reduzierte Col10a1 Expression, aber keine morphologischen Auffälligkeiten. Im Rahmen der in vitro Experimente mit TSG wurde die Notwendigkeit von stabilen und besser charakterisierten Zelllinien zur Analyse der Chondrozytendifferenzierung deutlich. Deshalb wurde die MC615 Zelllinie subkloniert, und die Subklone wurden hinsichtlich ihres Expressionsprofils sowie ihrer BMP Responsivität charakterisiert. Desweiteren wurden bei ausgesuchten Klonen das endogene Differenzierungspotential sowie die bei Differenzierung durch Langzeitkultur auftretenden Veränderungen in Matrixzusammensetzung und Expression von Markergenen analysiert. Dadurch konnten Zelllinien mit verschiedenen Differenzierungszuständen und unterschiedlichem Differenzierungspotential etabliert werden. Der Großteil dieser Arbeit widmet sich der Untersuchung eines bisher nicht bekannten differentiell epxrimierten Gens, das von Uwe Dietz im Rahmen einer Studie über Retinsäure induzierte Dedifferenzierung von murinen Chondrozyten gefunden wurde. Dieses Gen, im weiteren Ucma (unique cartilage matrix associated protein bzw. nach den Entdeckern Uwe; Cordula, Michael und Andreas) genannt, codiert für ein kurzes sezerniertes Protein, welches hauptsächlich in der Matrix von distalen Chondrozyten der Ruhezone vorkommt. Es ist in Wirbeltieren hochkonserviert, allerdings konnte im Huhngenom kein Ortholog identifiziert werden. Das rekombinant epxrimierte Protein wird vermutlich durch eine Subtilisin ähnliche Proproteinkonvertase weiter prozessiert und liegt dann in einer 9,5kDa großen tyrosinsulfatierten Form vor. Ucma wird ab Embryonaltag 13,5 hauptsächlich in Ruhezonenchondrozyten der Wirbelsäule und wenig später auch in Rippen- und Epiphysenknorpel exprimiert. Im Laufe der Embryonalentwicklung nimmt die Expressionsstärke vom Ucma zunächst zu; postnatal schwächt sich die Expression jedoch wieder deutlich ab. Auch in Zelllinien und den etablierten Differenzierungsmodellen von MC615 Subklonen ist die Expression von Ucma auf differenzierte Chondroyzten beschränkt, die aber noch nicht hypertrophiert sind. Dieses reifungsabhängige Abschalten der Expression könnte durch die Repression der Ucma Expression durch BMP-2, die in vitro nachgewiesen werden konnte, reguliert werden. Um die Rolle von Ucma in vivo zu studieren wurde es knorpelspezifisch unter dem Col2a1 Promotor überexprimiert. Die Analyse von 12 transgenen Mauslinien ergab keine auf die Expression des Transgens zurückzuführenden morphologischen Veränderungen. Allerdings war die Überexpression generell eher schwach ausgeprägt und daher das Ausbleiben eines offensichtlichen Phänotyps nicht verwunderlich. Zur Analyse der Funktion von Ucma in vitro wurde der Effekt des rekombinanten Proteins in verschiedenen Zellkultursystemen getestet. Dabei konnte keine Wirkung von Ucma auf Chondrozytendifferenzierung, Expressionsprofil und Zellproliferation beobachtet werden. Interessanterweise inhibierte Ucma die Differenzierung von MC3T3 Präosteoblasten zu Osteoblasten, was auf eine mögliche Rolle von Ucma als Vermittler zwischen Knorpel- und Knochendifferenzierung hindeutet.The replacement of cartilage by bone during skeletal development is a complex process called endochondral ossification. Elucidation of mechanisms underlying endochondral ossification and in particular chondrocyte differentiation could help to understand pathologenic mechanisms of growth retardation, in skeletal dysplasias and of osteoarthritis. The steps of chondrocyte differentiation are characterised by differentially expressed genes in resting, proliferating and hypertrophic chondrocytes. The aim of this work was to elucidate the role of two differentially expressed genes in cartilage development, TSG and Ucma. In the first part I report on the expression and function of twisted gastrulation (TSG), a known BMP (bone morphogenetic protein) regulator. During chondrocyte differentiation TSG was most abundant in hypertrophic chondrocytes; but it was also found in the resting zone. Recombinant TSG impaired BMP dependent Smad phosphorylation and subsequent Induction of Col2a1 and Col10a1 expression in MC615 cells and primary murine rib chondrocytes in vitro. Cartilage specific overexpression of TSG in mice under the Col2a1 promoter led to decreased Col10a1 expression but did not result in altered growth plate morphology. During the experiments with the MC615 cell line the need for stable and better characterised murine chondrocyte cell lines became apparent. Thus the MC615 cell line was subcloned and expression profiles as well as BMP-2 responsivity of the emerging subclones were determined. The differentiation capacity of selected clones was assessed by monitoring matrix formation and expression of marker genes in long term culture. Thereby chondrocyte cell lines of distinct differentiation status and capacity could be established. The main part of this work deals with the characterisation of a so far unknown differentially expressed gene, called Ucma. This gene was initially found by Uwe Dietz to be repressed during retinoic acid induced dedifferentiation of primary murine chondrocytes. The gene product was termed Ucma - unique cartilage matrix associated protein – for the main site of its occurrence. The Ucma gene is highly conserved among vertebrates exept chicken and codes for a short secreted protein localised in the matrix of distal chondrocytes. Recombinantly expressed Ucma was cleaved at a predicted subtilisin like proprotein convertase (SPC) recognition site. The resulting 9,5kDa protein is hydrophilic and was shown to be sulphated at distinct tyrosine residues. First Ucma mRNA expression was detected in vertebrae of E13,5 mouse embryos. Its maximum expression was observed in distal epiphyseal and vertebral chondrocytes between E18,5 and P2, declining later on. During differentiation of an MC615 subclone in vitro Ucma paralleled largely the expression of collagen II, and decreased with maturation to hypertrophic cells; it was downregulated by BMP-2. Thus it marks an early, distinct differentiation stage of chondrocytes. Recombinant Ucma did not affect expression of chondrocyte-specific genes or proliferation of chondrocytes, but interfered with osteogenic differentiation of MC3T3 preosteoblasts. Transgenic expression of Ucma in cartilage under the Col2a1 promoter did not show an obvious phenotype, most probable due to insufficient overexpression. Thus Ucma defines a new population of juvenile chondrocytes and may play a role in the assembly of cartilage as well as in the regulation of endochondral ossification
