Genome-wide screens to identify novel components of the metal response in Drosophila melanogaster

Abstract

Alle Organismen müssen Metallhomöostase sicherstellen, indem sie fluktuierende Mengen von Spurenelementen in der Umwelt bewältigen. Genetische und biochemische Studien in Säuger und Fliegen zeigten eine zentrale Rolle für den metalloregulatorische Protein MTF-1 (metal-responsive transcription factor) in der Homöostase von Übergangsmetallen. MTF-1 ist ein essentielles Gen in Säugern, währenddem es in Drosophila nicht überlebenswichtig ist. In beiden Fällen aber, in der Fliege und in Säugern, ist es ein kritischer Faktor für die Toleranz gegenüber Metallen und in Drosophila, unerwarteterweise auch gegenüber Kupfermangel. Obwohl grosse Fortschritte in der Biologie der Übergangsmetallen gemacht worden sind, bleibt das Wissen über Signalwege und Mechanismen der Antwort auf Metallstress lückenhaft. Auch ist wenig bekannt über die Gene, die in der unmittelbaren Handhabung von verschiedenen Metallen involviert sind. In dieser Studie versuchten wir, neue Komponenten der Antwort auf Metallstress in Drosophila melanogaster mit Hilfe einer Microarray basierten Transkriptom Analyse und genomweiter RNA Interferenz zu identifizieren. Zuerst wurde das Transkriptom von MTF-1 mutanten und wildtyp Larven verglichen. Beide Genotypen wurden in normalem Futter und solchem mit Metallzusätzen aufgezogen. Dadurch wurden neue, mögliche MTF-1 Zielgene gefunden, wie z.B. der Kupferimporter Ctr1B, der Zinkexporter ZnT-D1, der ABC Transporter CG10505 und die Ferritin-Gene Fer1HCH und Fer2LCH. Weitere biochemische und genetische Analysen in der Fliege bestätigten diese Kandidaten als MTF-1 Zielgene und erklärten einige Aspekte des Drosophila MTF-1 knockout Phänotyps. Ausserdem entdeckten wir eine Anzahl von Genen, die unabhängig von MTF-1 auf Metallzusatz reagierten. Unter diesen sind die Gene des Glutathion basierten Detoxifikation Signalwegs und die Gene involviert in Hitzeschock und Immunantwort. In der zweiten Analyse wurde ein genomweiter RNAi Screen in Drosophila S2 Zellkulturen durchgeführt, in Zusammenarbeit mit dem RNAi Screening Center an der Harvard Medical School. Der Screen identifizierte eine grosse Anzahl von Kandidatengenen, welche den Promotor vom Metallothionein A (MtnA) regulieren. MtnA ist eines der am Besten charakterisierten Zielgenen von MTF-1. Ein zweiter Screen mit hausinternen RNAi Verfahren wurde durchgeführt, um die Daten zu bestätigen. Einige Kandidatengene scheinen in einen Signalweg involviert zu sein, der den MtnA promotor reguliert. Weitere Studien sind notwendig für eine detaillierte Charakterisierung dieser Gene, und um ihren Platz in der Hierarchie der Antwort auf Metallstress zu bestimmen. All organisms have to ensure metal homeostasis by coping with fluctuating amounts of trace elements in the environment. Genetic and biochemical studies in mammals and Drosophila have established a central role for metal-responsive transcription factor MTF-1 in transition metal homeostasis. MTF-1 is an essential gene in mammals. In Drosophila, MTF-1 is not required for viability. However, in the fly, as in mammals, it is a critical factor for metal tolerance, and, unexpectedly, also for the copper starvation response. Even though great progress in the biology of transition metals has been made, there is still a lack of knowledge about the pathways and mechanisms leading to metal response and the genes involved in the immediate handling of various metals. In this study we attempted to identify novel components of the metal response using microarray based transcriptome analysis and genome-wide RNA interference technique in Drosophila melanogaster. Firstly, the transcriptome of MTF-1 mutant and wild type larvae, raised in normal or metal-supplemented food, was compared. This revealed new candidate MTF-1 target genes, such as the copper importer Ctr1B, the zinc exporter ZnT-D1, the ABC transporter CG10505, and the ferritin genes Fer1HCH and Fer2LCH. Further biochemical and genetic analyses in the fly established these candidates as genuine MTF-1 regulated genes and explained various aspects of Drosophila MTF-1 knockout phenotype. Moreover, we have uncovered a variety of genes that respond to metal load, independent of MTF-1. Among these are the genes involved in the glutathione- mediated detoxification pathway, and the genes of heat shock and immune responses. In the second analysis a genome-wide RNAi screen was done in cultured Drosophila S2 cells in collaboration with the RNAi Screening Center at Harvard Medical School. The screen identified a large number of candidate genes acting upstream of the promoter of metallothionein A, one of the best characterized target genes of MTF-1. A secondary screen using in house RNAi procedures was performed to validate the data. Several candidate genes appear to be involved in a pathway that regulates the metallothionein promoter. Future studies are needed for a detailed characterization of these genes and for placing them within the hierarchy of the metal stress response pathway