Molecular characterization and investigation of the differentiation potential of human mesenchymal stem cells

Abstract

Τα βλαστικά κύτταρα μονοπωλούν το ενδιαφέρον περισσότερο από κάθε άλλο πεδίο στη Βιολογία τα τελευταία χρόνια και αποτελούν σημαντικά εργαλεία στην ανεύρεση δυνητικών θεραπειών με εφαρμογή στα εκφυλιστικά νοσήματα και στην Αναγεννητική Ιατρική. Μια κατηγορία βλαστικών κυττάρων είναι τα μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα (MSCs). Τα MSCs αποτελούν ένα πληθυσμό προγονικών κυττάρων με δυνατότητα διαφοροποίησης σε επιμέρους ιστούς της μεσεγχυματικής σειράς και με ικανότητα αναγέννησης και in vivo αποκατάστασης του ομόλογου ιστού. Oι κύριες πηγές MSCs είναι ο μυελός των οστών (ΒΜ) και το αίμα ομφαλίου λώρου (UCB) που παρουσιάζουν όμως αρκετά προβλήματα και περιορισμούς και για αυτό το λόγο είναι αναγκαία η ανεύρεση εναλλακτικών πηγών αξιοποιήσιμων MSCs. Μια τέτοια πηγή, χωρίς την παρουσία ηθικών ζητημάτων, είναι και το αμνιακό υγρό (AF). Πιο συγκεκριμένα, στην παρούσα διδακτορική διατριβή απομονώθηκαν εμβρυϊκά MSCs από αμνιακό υγρό (AF-MSCs) δευτέρου τριμήνου κύησης και πραγματοποιήθηκε μοριακός και φαινοτυπικός χαρακτηρισμός τους. Αποδείχθηκε ότι τα κύτταρα εξέφραζαν το μεταγραφικό παράγοντα OCT-4, την πρωτεΐνη NANOG και τον επιφανειακό δείκτη SSEA-4, που αποτελούν χαρακτηριστικούς εμβρυϊκούς δείκτες ενώ ο ανοσοφαινοτυπικός χαρακτηρισμός των MSCs με κυτταρομετρία ροής απέδειξε ότι εξέφραζαν όλους τους μεσεγχυματικούς δείκτες Τέλος, όταν τα AF-MSCs καλλιεργήθηκαν υπό κατάλληλες συνθήκες με μέσα που περιείχαν τους απαραίτητους επαγωγικούς παράγοντες, αποδείχθηκε ότι μπορούσαν να διαφοροποιηθούν σε κύτταρα, προερχόμενα και από τα τρία βλαστικά δέρματα. Πιο συγκεκριμένα, τα AF-MSCs μπορούσαν να διαφοροποιηθούν προς λιποκύτταρα, οστεοκύτταρα, νευρικά κύτταρα και ηπατοκύτταρα. Ακολούθως, μελετήθηκε η ικανότητα απο- και δια-διαφοροποίησης των AF-MSCs. Πιο συγκεκριμένα, τα AF-MSCs μετά από καλλιέργειά τους με κατάλληλα πρωτόκολλα που προωθούν τη διαφοροποίησή τους προς λιποκύτταρα απο-διαφοροποιήθηκαν προς κύτταρα με προγονικό φαινότυπο (DAF-MSCs). Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε συγκριτική μελέτη των τριών παραπάνω κυτταρικών τύπων ως προς την έκφραση των εμβρυϊκών δεικτών OCT-4, SOX-2 και NANOG, ως προς τη μεταβολική τους ενεργότητα και ως προς το πρωτεομικό τους πρότυπο. Αποδείχθηκε ότι τα AF-MSCs και DAF-MSCs είχαν παρόμοιο γονιδιακό και πρωτεομικό πρότυπο ενώ εμφάνιζαν χαμηλότερη μεταβολική ενεργότητα σε σχέση με τα πλήρως διαφοροποιημένα λιποκύτταρα. Ακολούθως, τα λιποκύτταρα, προερχόμενα από ΑF-MSCs, δια-διαφοροποιήθηκαν προς ηπατοκύτταρα, όπου και διαπιστώθηκε ότι η διαδικασία δεν πραγματοποιήθηκε απ’ευθείας αλλά μέσω μετάβασης των λιποκυττάρων προς προγονικούς κυτταρικούς τύπους που ονομάστηκαν TRAF-MSCs (trans-differentiated AF-MSCs). Τέλος, έγινε συγκριτική μελέτη των TRAF-MSCs, των AF-MSCs και των DAF-MSCs και αποδείχθηκε ότι είχαν παρόμοιο φαινότυπο, εξέφραζαν τους εμβυϊκούς δείκτες OCT-4, SOX-2 και ΝΑΝΟG και διέθεταν παρόμοια μεταβολική ενεργότητα και κλωνογονική ικανότητα. Τέλος, η συστηματική ανάλυση του πρωτεομικού τους προτύπου έδειξε πολλές ομοιότητες και αποδείχθηκε ότι και οι τρεις κυτταρικές κατηγορίες εκκρίνουν αυξητικούς παράγοντες που σχετίζονται με την κυτταρική διαφοροποίηση και την ιστική αναγέννηση. Στη συνέχεια διερευνήθηκαν οι θεραπευτικές ιδιότητες των AF-MSCs στην οξεία ηπατική ανεπάρκεια (OHA), δεδομένου ότι τα MSCs δεν δημιουργούν τερατώματα in vivo και εμφανίζουν ανοσοκατασταλτικές ιδιότητες κατά τη μεταμόσχευσή τους σε ζωϊκά μοντέλα. Ειδικότερα, κατασκευάστηκε λεντιϊκός φορέας με το μόριο φθορισμού GFP για την επιτυχή διαμόλυνση των AF-MSCs και στη συνέχεια χορηγήθηκαν ΑF-MSCs ή ηπατικά προγονικά κύτταρα (ΗΠΚ) από ΑF-MSCs σε ζωϊκά πρότυπα που έπασχαν από οξεία ηπατική ανεπάρκεια. Ιδιαιτέρως, διαπιστώθηκε ότι τα AF-MSCs μπορούσαν να εποικίσουν το κατεστραμμένο ήπαρ και να συμβάλλουν στη βελτίωση του φαινοτύπου. Επιπλέον, μελετήθηκε και η παρακρινική δράση των κυττάρων αυτών στη θεραπεία της ΟΗΑ όπου και αποδείχθηκε ότι εκκρίναν αντι-φλεγμονώδεις κυτταροκίνες, όπως είναι η ιντερλευκίνη-10 (IL-10), καθώς και αυξητικούς παράγοντες που έχουν ρόλο στην ιστική επιδιόρθωση, γεγονός που συνέβαλλε στη βελτίωση της ηπατικής βλάβης. Συνεπώς, τα AF-MSCs αποτελούν μία εναλλακτική πηγή MSCs που χαρακτηρίζονται από ευρύ δυναμικό διαφοροποίησης και πλαστικότητας ενώ ταυτόχρονα εμφανίζουν θεραπευτική δράση σε ασθένειες, όπως είναι η ΟΗΑ, ιδιότητες που τα καθιστούν ιδιαίτερα σημαντικά εργαλεία σε εφαρμογές της Αναγεννητικής Ιατρικής