Role of neuropeptide corticotropin releasing hormone (CRH) and glucocorticoids in wound healing

Abstract

Cutaneous wound healing is a complex process tightly related to inflammation, which requires the cooperation of several different cell populations and factors. Corticotropin releasing hormone (CRH) is the main regulator of the hypothalamic‐pituitaryadrenal (HPA) axis, which mediates the body's response to stress, including inflammation. The stimulation of CRH by stressful stimuli leads to the release of adrenal glucocorticoids, a potent endogenous anti‐inflammatory agent. CRH exerts its effects through two main types of receptor, receptor 1, (CRF1) and receptor 2 (CRF2). The mRNA of CRH and the immunoreactive peptide and its receptors have been identified in a plethora of peripheral tissues including the skin. Although it has been shown that peripheral CRH possesses direct pro‐inflammatory action, its role in the process of cutaneous wound healing remains unclear. To study the role of CRH in cutaneous wound healing we used mice with genetic deletion of CRH (Crh‐/‐). CRH mRNA was detected in both normal and wounded skin of Crh+/+ mice. Crh‐/ ‐ mice characterized by accelerated wound healing which was accompanied by rapid progression of inflammation and re‐epithelialization from the second to the fifth day following the induction of wound compared to wild type mice. Moreover, Crh‐/‐ mice had higher levels of TGF‐β1 on day 3 when compared with Crh+/+ mice. The replacement of glucocorticoids on Crh‐/‐ mice accelerated the wound healing even more during the first day following the induction of wound compared with vehicle alone‐treated Crh‐/‐ mice and simultaneously accelerated the resolution of the inflammatory response and increased the number and organization speed of fibroblasts. Finally, administration of corticosterone restored the tissue levels of TGF‐β1 in Crh‐/‐ mice to those observed in Crh+/+ mice. Our results suggest that genetic deficiency of CRH is associated with accelerated wound healing characterized by increased epithelialization and presence of fibroblasts in the area of the wound in a manner independent of glucocorticoids insufficiency. To clarify the role of endogenous CRH in the function of fibroblasts during wound healing we used primary cultures of fibroblasts derived from neonatal skin of Crh +/+ and Crh‐/‐ mice. Our studies showed that Crh is expressed in wild type fibroblasts. Moreover, fibroblasts of both genotypes have functional receptors, as they induce the production of cAMP. Fibroblasts with genetic deficiency of CRH have higher proliferation and migration rate and decreased production of IL‐6, TGF‐β1 and collagen in comparison with the corresponding wild type fibroblasts. The pharmacological blockade of CRF1 using antalarmin in cultured human fibroblasts led to similar changes on the rate of proliferation and migration and secretion of IL‐6, with those observed in Crh ‐/‐ fibroblasts. These results reinforce the importance of CRH in the biology of skin fibroblasts during wound healing. In summary, our findings from in vivo and in vitro experiments demonstrate for the first time the important role of locally produced CRH in cutaneous wound healing. The exact mechanism of action has not been clarified. However it appears that fibroblasts are an important component in this process.Η δερματική τραυματική επούλωση είναι μία σύνθετη διαδικασία, άρρηκτα συνδεδεμένη με τη φλεγμονή, που απαιτεί τη συνεργασία πολλών διαφορετικών κυτταρικών πληθυσμών και παραγόντων. Η εκλυτική ορμόνη της κορτικοτροπίνης (CRH) αποτελεί τον κύριο ρυθμιστή του υποθαλαμικού‐υποφυσιακού‐επινεφριδιακού (HPA) άξονα, ο οποίος μεσολαβεί την απόκριση του οργανισμού στο στρες, συμπεριλαμβανομένης και της φλεγμονής. Η διέγερση της CRH από στρεσογόνα ερεθίσματα οδηγεί στην απελευθέρωση των επινεφριδιακών γλυκοκορτικοειδών, ενός ισχυρού ενδογενούς αντιφλεγμονώδους μέσου. Η CRH ασκεί τις δράσεις της μέσω δύο κύριων τύπων υποδοχέων, τον υποδοχέα 1 της CRH (CRF1) και τον υποδοχέα 2 της CRH (CRF2). Το mRNA της CRH καθώς και το ανοσοδραστικό πεπτίδιο και οι υποδοχείς της έχουν εντοπιστεί σε πληθώρα περιφερικών ιστών συμπεριλαμβανομένου του δέρματος. Αν και έχει δειχθεί ότι η περιφερική CRH ασκεί άμεση προ‐φλεγμονώδη δράση, εντούτοις ο ρόλος της στη διαδικασία της δερματικής τραυματικής επούλωσης παραμένει αδιευκρίνιστος. Προκειμένου να μελετηθεί ο ρόλος της CRH στην επούλωση του δερματικού τραύματος χρησιμοποιήθηκαν μύες στους οποίους είχε γίνει απαλοιφή του γονιδίου της CRH (Crh/ ). Η CRH ανιχνεύθηκε τόσο σε φυσιολογικό όσο και τραυματισμένο δέρμα Crh+/+ μυών. Οι Crh/ μύες χαρακτηρίζονταν από επιταχυμένη τραυματική επούλωση η οποία συνοδευόταν από ταχύτερη εξέλιξη της φλεγμονής και της επαναεπιθηλιοποίησης από τη δεύτερη έως την πέμπτη ημέρα μετά την επαγωγή του τραύματος συγκριτικά με τους μύες αγρίου τύπου. Επιπλέον οι Crh/ μύες είχαν υψηλότερα επίπεδα TGF‐β1 την 3η ημέρα όταν συγκρίνονταν με τους Crh+/+ μύες. Η αποκατάσταση των γλυκοκορτικοειδών στους Crh/ μύες επιτάχυνε την τραυματική επούλωση ακόμα περισσότερο την πρώτη ημέρα μετά την επαγωγή του τραύματος συγκριτικά με τους Crh/ μύες στους οποίους δε χορηγήθηκε κορτικοστερόνη και ταυτόχρονα επιτάχυνε τη λύση της φλεγμονώδους αντίδρασης και αύξησε τον αριθμό και την ταχύτητα οργάνωσης των ινοβλαστών. Τέλος, η χορήγηση κορτικοστερόνης επανέφερε τα ιστικά επίπεδα του TGF‐β1 στους Crh‐/‐ μυς σε αυτά που παρατηρούνταν Crh/ στους μύες. Τα παραπάνω αποτελέσματα δείχνουν ότι η γενετική έλλειψη CRH συνδέεται με επιταχυμένη τραυματική επούλωση που χαρακτηρίζεται από αυξημένη επιθηλιοποίηση και παρουσία ινοβλαστών στην τραυματική περιοχή κατά τρόπο ανεξάρτητο των γλυκοκορτικοειδών. Για να αποσαφηνιστεί ο ρόλος της ενδογενούς CRH στη λειτουργία των ινοβλαστών κατά τη διάρκεια της επούλωσης χρησιμοποιήθηκαν πρωτογενείς καλλιέργειες ινοβλαστών προερχόμενες από δέρμα νεογνών Crh+/+ και Crh/ μυών. Οι μελέτες μας έδειξαν ότι η Crh εκφράζεται στους ινοβλάστες μυών αγρίου τύπου. Επιπλέον, οι ινοβλάστες και των δύο γονοτύπων διαθέτουν λειτουργικούς υποδοχείς, καθώς επάγουν την παραγωγή cAMP. Οι ινοβλάστες με γενετική έλλειψη CRH παρουσίαζαν υψηλότερο ρυθμό πολλαπλασιασμού και μετανάστευσης και μειωμένη παραγωγή IL‐6, TGF‐β1 και κολλαγόνου σε σύγκριση με τους ινοβλάστες αγρίου τύπου. Ο φαρμακολογικός αποκλεισμός του CRF1 με τη χρήση ανταλαρμίνης σε καλλιέργειες ανθρώπινων ινοβλαστών επέφερε παρόμοιες αλλαγές αναφορικά με το ρυθμό πολλαπλασιασμού και μετανάστευσης και την έκκριση IL‐6, με αυτές που παρατηρούνταν στους Crh / ινοβλάστες. Τα αποτελέσματα αυτά ενισχύουν το σημαντικό ρόλο που διαδραματίζει η CRH στη βιολογία των δερματικών ινοβλαστών κατά τη διάρκεια της αποκατάστασης του τραύματος. Συνοψίζοντας, τα ευρήματά μας, από in vivo και in vitro πειράματα, καταδεικνύουν για πρώτη φορά το σημαντικό ρόλο της τοπικά παραγόμενης CRH στη δερματική τραυματική επούλωση. Ο ακριβής μηχανισμός της δράσης της αυτής δεν έχει διασαφηνισθεί. Παρόλα αυτά φαίνεται ότι οι ινοβλάστες αποτελούν σημαντική συνιστώσα στη διαδικασία αυτή