Immunohistochemical, immunology-related and genetic analysis in specialized intestinal metaplasia of oesophagus

Abstract

Barrett's Εsophagus (BΕ) represents the most serious histological consequence of chronic GERD whose incidence is progressively increasing. Moreover GERD plays a crucial role in the pathophysiology and the clinical identification of BE, a well-recognized premalignant condition playing a pivotal role in the development of Esophageal Adenocarcinoma (EA). The incidence of EA is estimated at 0.5-5% annually, depending on the size of the examined population, and the relative risk is 7-fold and 43-fold higher in GERD patients and in patients with long-term symptoms, respectively. The importance of the GERD-BE-EA sequence is strengthened by epidemiologic data showing that EA is now the most common esophageal malignancy worldwide and the incidence of this highly lethal cancer is increasing faster than any other cancer. Mortality rates recorded for EA per 100,000 population are roughly 8 in the USA, 13 in Japan, 17 in France and 36 in China. On the other hand, contrary to the reported international data, mortality from esophageal cancer in Greece is among the lowest in the world (3.5 per 100,000 person-years: WHO 1995) and no clear-cut answer has emerged as to why the incidence of EA is so low in Greece. It has been argued that populations with unusually low disease rates can provide valuable insights into the etiologic processes. Previous studies attempted to identify risk factors in dietary, life-style and medical conditions of the Greek population, yet no clear-cut answer has emerged as to why the incidence of EA is so low in Greece. Given that BE is the only known precursor to EA, every patient with BE should be enrolled in an endoscopic surveillance program. However, endoscopic and histopathological follow-up indicates that most of BE patients do not progress to cancer. Considering the surveillance limitations, the search for surrogate biomarkers for EA development in patients with BE appears to be of great practical importance. Several molecular biomarkers have been described in BE such as those associated with oncogenes activation and growth regulation (Ki-67), tumor suppressor genes inactivation (p53) and DNA mismatch repair genes dysregulation leading to characteristic phenotype microsatellite instability (MSI). Moreover, recent research is focused on dysregulation of apoptosis (involving Fas-FasL complex, Bax and Bcl-2 family proteins) and defective immune surveillance mechanisms leading to oncogenesis in BE. In this regard, important conclusions may be drawn when these surrogate markers are taken into account and linked with epidemiological data. Recent data show that Helicobacter pylori (H. pylori) is frequent in GERD and H. pylori eradication leads to better control of GERD symptoms and improves esophagitis. H. pylori may contribute to GERD pathogenesis by several mechanisms including: release of several mediators, cytokines and nitric oxide which may adversely affect the lower esophageal sphincter (LES); direct damage of the esophageal mucosa by bacterial products; increased production of prostaglandins that sensitize afferent nerves and reduce LES pressure; and augmented acidity (by gastrin release) that exacerbate GERD. Moreover, recent evidence indicates that: a) H. pylori infection prevalence is high in BE; b) cagA-171 positive H. pylori infection is not associated with decreased risk of BE; c) the expected incidence of EA with persistent H. pylori infection is higher than that of EA after eradication of infection; and d) H. pylori induces Ki-67 expression and Ki-67 proliferation fraction increases significantly from normal squamous epithelium to BE–dysplasia–EA. Therefore, H. pylori might be involved in the GERD-BE-EA sequence and its eradication might inhibit the progress of this sequence. The aim of the present study was to investigate the potential implication of H. pylori infection in GERD-BE-EA sequence in a Greek cohort of BE patients and GERD controls and to provide a plausible explanation for the low incidence of EA in Greece through molecular-based ethnic differentiations. Between January 2002 and January 2006, 270 patients underwent upper gastrointestinal endoscopy due to GERD symptoms at the Second Medical Clinic of the Aristotle University of Thessaloniki. Of this total group, 31 patients with endoscopic abnormalities in the distal esophagus indicating short/long BE (typical salmon-pink lesions) were ultimately included in the study. The patients with BE were matched with 21 GERD controls. All participants underwent the following: 1. Endoscopic and histologic examination for detection of H. pylori infection. 2. Immunohistochemical evaluation of the esophageal epithelium and gastric mucosa expression for: a. oncogene Ki-67 b. tumor suppressor gene p53 c. anti-apoptotic oncogene Bcl-2 d. pro-apoptotic gene Bax 3. Immune surveillance mechanisms evaluation: a. locally (esophageal epithelium and gastric mucosa) by immunohistochemical evaluation of expression of B-lymphocytes (Β-Λ, CD20), T-lymphocytes (TLs, CD45RO) and Fas antigen (CD95) b. systemically (peripheral blood) by flow cytometry evaluation of natural killer cells [CD3-/CD(16/56)+], helper (CD4+) T-Lymphocytes(TLs), cytotoxic (CD8+) T-Lymphocytes (TLs) and total (CD3+) T-Lymphocytes (TLs) 4. Presence of microsatellite instability (MSI). From the data analysis in this series we concluded: 1. H. pylori infection was present in a great proportion of our patients (BE and GERD), implying that the bacterium may be responsible for the pathogenesis of GERD-BE-EA sequence. This finding is in accordance with recent literature. 2. Increased expression of oncogene Ki-67 was observed in esophageal epithelium of BE patients compared to GERD controls indicating intense cell proliferation leading to oncogenesis. 3. Absence of difference of tumor suppressor gene p53 expression in BE patients and GERD controls suggesting a minor role of this oncogene in the GERD-BE-EA sequence in this particular population. 4. Overexpression of Bax was noticed in esophageal epithelium and gastric mucosa of BE patients compared to GERD controls, indicating intense activation of pro-apoptotic mechanisms. This finding is inconsistent with the worldwide literature data. 5. Absence of difference of antiapoptotic Bcl-2 protein expression in BE patients and GERD controls and moreover complete absence in ~55% and ~76% of BE and GERD patients, respectively. 6. MSI presence in only 1 BE patient with H. pylori infection. This finding is in accordance with worldwide literature data showing that only the minority of BE associated EA expresses DNA-MMR damage. 7. Overexpression of T-lymphocytes (TLs) in esophageal epithelium and gastric mucosa of BE patients compared to GERD controls. 8. Overexpression of helper (CD4+) T-Lymphocytes (TLs) in peripheral blood of BE patients attributed to H. pylori (+) subgroup of these patients and natural killer cells [CD3-/CD(16/56)+] in GERD controls; the latter parameter, however, did not differ between the subgroups of H. pylori (+) BE and GERD patients. 9. Overexpression of Fas antigen (CD95) in the mucosa of gastric body and antrum, respectively, of BE patients and GERD controls. Considering the above-mentioned data we can speculate that, in the presence of H. pylori infection, a possible existence of a balance between cell proliferation (indicated by oncogene Ki-67 increased expression) and apoptosis (indicated by Bax protein overexpression) or a trend of a pro-apoptotic mechanisms predominance in BE patients (indicated by Bax protein overexpression and Bcl-2 expression in ~ 94% and only ~45%, respectively) may partly explain the low EA incidence in Greece. Moreover the results of this series suggest the presence of a cellular immune response that might inhibit the induction of a malignant phenotype in GERD-BE-EA sequence, thereby providing an additional protective mechanism that could explain the low EA incidence in Greece. We also observed comparable data in Greek patients with inflammatory bowel disease (IBD) related low incidence of colorectal cancer. Contrary to the data of other countries, the incidence of cancer in Greek patients with IBD also appears to be low, although as yet there is no possible explanation for this observation. However, in a recent pilot study involving Greek patients with Crohn’s disease (CD) and ulcerative colitis (UC), an increased mucosal expression of Bax protein was noticed in 62% and 50% of the patients, respectively. In addition, Bcl-2 protein was overexpressed in 25% and 50% patients with CD and UC, respectively. Moreover, an elevated expression of oncogene Ki-67 was also observed in 3/4 of the patients. These preliminary results suggest a possible existence of a balance between: a) cell pro-apoptotic and anti-apoptotic mechanisms in UC, indicated by Bax and Bcl-2 overexpression in 50% of the patients, with a great propensity of pro-apoptotic mechanisms in CD, indicated by Bax and Bcl-2 overexpression in 62% and 25% of the patients respectively, and b) between cell proliferation (indicated by Ki-67 overexpression) and apoptosis (indicated by Bax protein overexpression), thereby reflecting a coherent apoptotic process that might explain, at least in part, the low incidence of cancer development in Greek IBD patients. In view of the pathogenetic importance of H. pylori infection in GERD-BE-EA sequence, the findings of the present study remain to be elucidated and confirmed by other large cohort studies.Ο Οισοφάγος Barrett’s (ΟΒ) αντιπροσωπεύει σοβαρή ιστολογική επιπλοκή της γαστροοισοφαγικής παλινδρομικής νόσου (ΓΟΠΝ) του οποίου ο επιπολασμός φαίνεται ότι προοδευτικά αυξάνει. Ο ΟΒ ως προνεοπλασματική βλάβη, ενέχει αυξημένο κίνδυνο αναπτύξεως ΟΑ, το οποίο απαντά σε αναλογία 0,5-5% ετησίως, με ποσοστά που ποικίλουν αναλόγως του μεγέθους του εξεταζομένου πληθυσμού. Επιπλέον, η ΓΟΠΝ ως υποκείμενη νόσος του ΟΒ, αποτελεί καθαυτή ομάδα κινδύνου για ανάπτυξη OA. Ο σχετικός κίνδυνος αναπτύξεως ΟΑ είναι 5-7 φορές μεγαλύτερος σε ασθενείς με ΓΟΠΝ και 43 φορές μεγαλύτερος σε ασθενείς με μακροχρόνια ΓΟΠΝ. Η σοβαρότητα της αλληλουχίας ΓΟΠΝ-ΟΒ-ΟΑ, ενισχύεται επιπλέον από επιδημιολογικά δεδομένα που δείχνουν ότι τo OA αναδεικνύεται ως κακοήθεια της γαστρεντερικής οδού που παρουσιάζει υψηλή και προοδευτικά αυξανόμενη συχνότητα παγκοσμίως, αποτελεί δε το συχνότερο οισοφαγικό νεόπλασμα σχετιζόμενο άμεσα με τη ΓΟΠΝ, το οποίο ταχέως εξελίσσεται και συνοδεύεται από υψηλή θνητότητα. Τα ποσοστά θνητότητας που καταγράφονται από οισοφαγικό καρκίνο ανά 100.000 πληθυσμού είναι περίπου 8 στις ΗΠΑ, 13 στην Ιαπωνία, 17 στη Γαλλία και 36 στην Κίνα. Εντούτοις, σε αντίθεση με τα αναφερόμενα διεθνή δεδομένα θνητότητας του οισοφαγικού καρκίνου, η αντίστοιχη θνητότητα στην Ελλάδα είναι από τις χαμηλότερες στον κόσμο (3,5 ανά 100.000, WHO 1995) χωρίς να υφίσταται σαφής εξήγηση του φαινομένου αυτού. Έχει υποστηριχτεί η άποψη ότι οι πληθυσμοί με ιδιαίτερα χαμηλή συχνότητα εμφάνισης συγκεκριμένων ασθενειών, όπως ΟΑ, δίνουν το έναυσμα σχετικής έρευνας εις βάθος που δυνατόν να παράσχει χρήσιμα στοιχεία αναφορικά με τις παθογενετικές και αιτιολογικές διαδικασίες. Η σχετική έρευνα εστιάζεται κατά κύριο λόγο στην αναφερόμενη αλληλουχία ΟΒ-δυσπλασία-ΟΑ που, όπως στην περίπτωση του καρκίνου του παχέος εντέρου, είναι το αποτέλεσμα προοδευτικής συσσωρεύσεως μοριακών γενετικών μεταβολών και περιλαμβάνουν κυρίως τρεις βασικούς παράγοντες: ενεργοποίηση ογκογονιδίων (Ki-67), αδρανοποίηση ογκοκατασταλτικών γονιδίων (p53) και μεταβολές των επιδιορθωτικών του DNA γονιδίων που οδηγούν στο χαρακτηριστικό φαινότυπο της μικροδορυφορικής αστάθειας (microsatellite instability, MSI). Επίσης, η έρευνα εστιάζεται στις διαταραχές της αποπτωτικής διεργασίας και ανοσιακής απόκρισης που πιθανόν να εμπλέκονται στην αναφερόμενη αλληλουχία ογκογενέσεως του ΟΒ. Οι πολύπλοκοι παθοφυσιολογικοί μηχανισμοί πρόκλησης ΓΟΠΝ, ΟΒ και ΟΑ στους οποίους εμπλέκονται οι αναφερόμενοι παράγοντες, παρουσιάζουν σε πολλά σημεία αρκετές ομοιότητες με παθοφυσιολογικούς μηχανισμούς επαγωγής βλάβης λόγω λοίμωξης από Hp, που αποτελεί καρκινογόνο 1ης κλάσης σύμφωνα με την WHO. Το γεγονός αυτό υποδηλώνει πιθανή εμπλοκή του Hp στην πρόκληση της αλληλουχίας ΓΟΠΝ-ΟΒ-ΟΑ, η δε συσχέτιση αυτή αποτελεί αντικείμενο έντονης επιστημονικής μελέτης με σχετικές αντιπαραθέσεις. Παρά την ύπαρξη αντιφατικών δεδομένων, η Hp-λοίμωξη επηρεάζοντας ογκογονίδια και διεργασίες αποπτώσεως ή ανοσιακής απόκρισης πιθανόν να εμπλέκεται στην αλληλουχία ΓΟΠΝ-ΟΒ-ΟΑ, η δε εκρίζωση του βακτηριδίου πιθανόν να επιδρά ανασταλτικά στην ογκογένεση της περιοχής αυτής της άνω πεπτικής οδού. Σκοπός της μελέτης αυτής ήταν η προσπάθεια διερεύνησης της εμπλοκής της Hp-λοίμωξης στην εξελικτική διεργασία ΓΟΠΝ-ΟΒ-ΟΑ και πιθανής επεξήγησης της χαμηλής επίπτωσης ΟΑ στον Ελλαδικό χώρο. Για τον σκοπό αυτό η σχετική έρευνα εστιάστηκε στα ακόλουθα: 1. Ενδοσκοπικός και ιστολογικός έλεγχος ασθενών με ΟΒ και μαρτύρων με ΓΟΠΝ για ανίχνευση παρουσίας Hp-λοιμώξεως 2. Ανοσοϊστοχημικός προσδιορισμός έκφρασης στο οισοφαγικό επιθήλιο και γαστρικό βλεννογόνο: α) ογκογονιδίου Ki-67 β) ογκοκατασταλτικού γονιδίου p53 γ) αντιαποπτωτικού ογκογονιδίου Bcl-2 δ) αποπτωτικού γονιδίου Βax 3. Έλεγχος και εκτίμηση της ανοσιακής απόκρισης: α) σε τοπικό επίπεδο (οισοφαγικό επιθήλιο και γαστρικό βλεννογόνο) με ανοσοϊστοχημικό προσδιορισμό των Β-Λεμφοκυττάρων (Β-Λ, CD20), των Τ-Λεμφοκυττάρων (Τ-Λ, CD45RO) και του Fas υποδοχέα (CD95) β) σε συστηματικό επίπεδο (περιφερικό αίμα) με προσδιορισμό των ολικών (CD3+) Τ-Λεμφοκυττάρων (Τ-Λ), των βοηθητικών (CD4+) Τ-Λεμφοκυττάρων (Τ-Λ), των κυτταροτοξικών (CD8+) Τ-Λεμφοκυττάρων (Τ-Λ) και των φυσικών κυτταροκτόνων κυττάρων [CD3-/CD(16/56)+] με κυτταρομετρία ροής 4. Παρουσία μικροδορυφορικής αστάθειας (ΜSI) 5. Συσχέτιση των μελετούμενων παραμέτρων με την παρουσία ή μη του Hp. Στην παρούσα μελέτη συμπεριελήφθησαν συνολικά 31 ασθενείς με ΟΒ και 21 ασθενείς με ΓΟΠΝ οι οποίοι απετέλεσαν την ομάδα ελέγχου. Οι εξεταζόμενοι υποβλήθηκαν σε ενδελεχή ενδοσκοπικό και ιστολογικό έλεγχο του ανωτέρου πεπτικού με συνοδό λήψη δειγμάτων περιφερικού αίματος για την εκτίμηση των αναφερθέντων παραμέτρων. Από την ανάλυση των ευρημάτων διαπιστώσαμε: Ι. Παρουσία Η. pylori λοιμώξεως σε μια σημαντική αναλογία των ασθενών μας με ΓΟΠΝ και ΟΒ, υποδηλώνοντας ότι το βακτηρίδιο ευθύνεται στην αιτιοπαθογένεια της αναφερόμενης αλληλουχίας, εύρημα που έρχεται σε συμφωνία με ένα μεγάλο αριθμό σύγχρονων τυχαιοποιημένων μελετών. ΙΙ. Συγκριτικά με την ομάδα ελέγχου, υπερέκφραση του ογκογονιδίου Ki-67 στο οισοφαγικό επιθήλιο των ασθενών με ΟΒ, το οποίο έχει δειχθεί ότι επάγει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την ογκογένεση. ΙΙΙ. Απουσία διαφοράς εκφράσεως του ογκοκατασταλτικού γονιδίου p53 στο οισοφαγικό επιθήλιο στους ασθενείς με ΟΒ και τους μάρτυρες με ΓΟΠΝ, υποδηλώνοντας πιθανή έλλειψη ουσιώδους συμμετοχής του ογκοκατασταλτικού αυτού γονιδίου στην αλληλουχία ΓΟΠΝ-ΟΒ-ΟΑ στο συγκεκριμένο δείγμα πληθυσμού. IV. Υπερέκφραση της αποπτωτικής Bax πρωτεΐνης στο οισοφαγικό επιθήλιο και γαστρικό βλεννογόνο στη συντριπτική πλειοψηφία των ασθενών με ΟΒ συγκριτικά με τους μάρτυρες, εύρημα που βρίσκεται σε αντίθεση με αντίστοιχα διεθνή δεδομένα, είναι δε ενδεικτικό έντονης ενεργοποίησης των αποπτωτικών μηχανισμών. V. Απουσία διαφοράς εκφράσεως της αντιαποπτωτικής Bcl-2 πρωτεΐνης στο οισοφαγικό επιθήλιο στους ασθενείς με ΟΒ και τους μάρτυρες με ΓΟΠΝ και έλλειψη της παρουσίας της στο ~55% και ~76% των ασθενών με ΟΒ και ΓΟΠΝ, αντίστοιχα. VΙ. Παρουσία MMR μόνο σε μία περίπτωση ασθενούς με ΟΒ και συνοδό Ηp-λοίμωξη, επιβεβαιώνοντας διεθνή δεδομένα που δείχνουν ότι μόνο η μειονότητα των ΟΒ-σχετιζόμενων ΟΑ εκδηλώνουν MMR βλάβη. VΙΙ. Αυξημένη παρουσία Τ-Λ στον οισοφαγικό και γαστρικό βλεννογόνο καρδίας και σώματος των ασθενών με ΟΒ σε σύγκριση με την ομάδα των μαρτύρων. VΙΙΙ. Αυξημένη αναλογία των βοηθητικών (CD4+) Τ-Λ στο περιφερικό αίμα των ασθενών με ΟΒ που αφορούσε κατεξοχήν την υποομάδα των Ηp θετικών ασθενών με ΟΒ και αυξημένη αναλογία των φυσικών κυτταροκτόνων κυττάρων [CD3-/CD(16/56)+] στην συνολική ομάδα των μαρτύρων χωρίς όμως η τελευταία αναλογία να διαφέρει μεταξύ των 2 υποομάδων Ηp θετικών ασθενών με ΟΒ και μαρτύρων. ΙX. Αυξημένη έκφραση του σχετιζόμενου με απόπτωση Fas αντιγόνου (CD95) στον βλεννογόνο του σώματος και άντρου του στομάχου, αντίστοιχα, των ασθενών με ΟΒ και των μαρτύρων με ΓΟΠΝ. Τα ευρήματα αυτά δείχνουν ότι κυρίως σε έδαφος Ηp-λοιμώξεως, η παρουσία πιθανής ισορροπίας μεταξύ του κυτταρικού πολλαπλασιασμού (υποδηλούμενης από την ανευρεθείσα αυξημένη έκφραση του ογκογονιδίου Ki-67) και της αποπτώσεως (υποδηλούμενης από την ανευρεθείσα υπερέκφραση της Bax πρωτεΐνης) ή τάσης επικράτησης των αποπτωτικών μηχανισμών στον ΟΒ (υποδηλούμενη από την υπερέκφραση της Bax και έκφραση της Bcl-2 στο ~94% και μόνον στο ~45% των ασθενών με ΟΒ, αντίστοιχα) πιθανόν να εξηγεί, τουλάχιστον εν μέρει, τη χαμηλή επίπτωση ΟΑ στην Ελλάδα. Επιπλέον, τα ευρήματα αυτά πιθανολογούν υφιστάμενη επαρκή κυτταρική ανοσία που πιθανόν να παρεμποδίζει την επαγωγή κακοήθους φαινοτύπου και εξαλλαγής της σχετιζόμενης με Ηp αλληλουχίας ΓΟΠΝ-ΟΒ-ΟΑ, δίνουν δε μια επιπλέον εξήγηση για το χαμηλό επιπολασμό του ΟΑ στον Ελλαδικό χώρο. Εντούτοις, απαιτούνται μελέτες σε μεγάλο αριθμό ασθενών για να διευκρινίσουν εις βάθος, αυτό το πεδίο της ογκογένεσης του οισοφάγου