Crosstalk between redox regulatory pathways and epigenetic processes in tissue and cell culture models of cardiovascular complications

Abstract

Oxidative stress is caused by an imbalance between the production of reactive oxygen species (ROS) and the neutralization of these species by antioxidant systems, leading to a disruption of redox signaling, oxidative damage and potential pathological consequences, including cardiovascular complications. There is a growing body of evidence that ROS influence epigenetic pathways by affecting the function or levels of epigenetic modulators, such as histone modifying enzymes. Since epigenetic modifications are increasingly recognized as major players in cardiovascular disease development and progression, investigation of the interplay between redox signaling and epigenetic regulation is of particular interest in this context. A readout assay for the detection of protein S-nitros(yl)ation, a redox modification, was established using an approach consisting of light-induced homolysis of nitros(yl)ated proteins and subsequent immuno-spin trapping of generated protein radicals via 5,5 dimethyl-1 pyrroline N-oxide (DMPO) and a respective antibody. In order to investigate ROS-induced epigenetic changes, a suitable model system with elevated ROS formation had to be established. Culturing endothelial cells under hyperglycemic conditions is known to generate increased oxidative stress. However, no substantial effects on ROS formation and histone methylation and acetylation patterns could be observed in the endothelial cell line EA.hy926 upon hyperglycemia, possibly due to a systematical technical error that, however, could not be identified despite multiple methodological variations. In mice deficient in the antioxidant protein glutathione peroxidase-1 (GPx-1) endothelial dysfunction and enhanced ROS levels have been reported previously, an effect that was further potentiated by aging. Epigenetic analysis of this model led to the hypothesis of potential dityrosine cross-linking between histone 3 and histone 4 accompanied by enhanced histone 3 lysine 9 dimethylation upon increased oxidative stress. However, upon further investigation by mass spectrometry and exclusion of antibody cross-reactivity to IgGs in the animal samples this assumption was revealed to be false. In a published study by our group it was demonstrated that empagliflozin, a selective sodium-glucose co transporter 2 inhibitor (SGLT2i), reduced glucotoxicity and thereby prevented the development of endothelial dysfunction, reduced oxidative stress and exhibited anti-inflammatory effects in ZDF rats, an animal model for type 2 diabetes mellitus (T2DM). Investigation of involved epigenetic mechanisms by chromatin immunoprecipitation (ChIP) analysis revealed an effect of empagliflozin treatment on expression of glucotoxicity- and inflammation-markers in diabetic animals via altered histone methylation patterns. Finally, the interplay of increased ROS formation and epigenetic alterations was studied in H9c2 cardiomyocytes with a doxorubicin-induced cardiotoxic phenotype. It was discovered that doxorubicin treatment affected the expression of certain epigenetic modulators in correlation with increased oxidative stress markers. Given that epigenetic changes are reversible, they represent potential intervention targets as well as biomarkers that can be addressed for drug discovery. Thus, establishing a comprehensive understanding of the interplay of ROS and epigenetic mechanisms in cardiovascular related diseases may lead to the development of novel and precisely targeted treatment options.Der Ausdruck „oxidativer Stress“ bezeichnet ein Ungleichgewicht zwischen der Entstehung freier reaktiver Sauerstoffradikale (ROS) und deren Neutralisierung durch anti-oxidative Mechanismen. Oxidativer Stress führt zur Beeinträchtigung der zellulären Redox-Regulation, Entstehung oxidativer Schädigungen und letztendlich zu möglichen pathologischen Konsequenzen, wie z.B. kardiovaskulären Erkrankungen. Immer mehr Forschungsresultate deuten darauf hin, dass ROS epigenetische Prozesse beeinflussen, indem sie die Funktion oder Konzentration epigenetischer Modulatoren, wie z.B. Histon-Modifikatoren, verändern. Da epigenetische Modifikationen zunehmend mit der Entwicklung und dem Fortschreiten kardiovaskulärer Erkrankungen in Verbindung gebracht werden, ist es von großem Interesse das Zusammenspiel von Redox-Signalwegen und epigenetischer Regulierung vor diesem Hintergrund zu untersuchen. In dieser Arbeit wurde zunächst ein Testverfahren zur Detektion von Protein S-Nitros(yl)ierung, einer Redox-Modifikation, erstellt. Dieses beinhaltete die Licht-induzierte Homolyse der nitros(yl)ierten Proteine, Immuno-Spin Trapping der entstehenden Radikale mithilfe von 5,5 Dimethyl-1 pyrroline N-oxid (DMPO) und Detektion durch einen entsprechenden Antikörper. Um ROS-induzierte epigenetische Veränderungen zu untersuchen, musste ein geeignetes Modellsystem etabliert werden, welches erhöhten oxidativen Stress aufweist. Es ist bekannt, dass Endothelzellen bei Kultivierung mit erhöhter Glukose-Konzentration vermehrt ROS bilden. Dennoch konnten gegenwärtig in diesem Modell keine erheblichen Effekte auf die ROS-Bildung und Histon-Modifikationen festgestellt werden, was möglicherweise auf ein systematisches methodologisches Problem zurückzuführen ist, das trotz intensiver Variation der Versuchsbedingungen nicht identifiziert werden konnte. In einer vorherigen Studie wurde in Mäusen mit Knock out des anti-oxidativen Enzyms Glutathionperoxidase-1 (GPx-1) eine endotheliale Dysfunktion und erhöhter oxidativer Stress verzeichnet, wobei dieser Effekt bei höherem Alter verstärkt war. Epigenetische Analysen dieses Modells führten zu der Hypothese, dass bei hohem oxidativen Stress Dityrosin-Brücken (=kovalente Bindungen) zwischen Histon 3 und Histon 4 gebildet werden, zusammen mit verstärkter Dimethylierung von Lysin 9 an Histon 3 (H3K9me2). Allerdings stellte sich bei weiteren Untersuchungen mittels Massenspektrometrie und Verwendung von Sekundärantikörpern mit garantierter Abwesenheit von Kreuzreaktivitäten gegenüber den IgGs der Tierproben heraus, dass diese Annahme falsch war. In einer von uns publizierten Studie wurde gezeigt, dass Empagliflozin, ein selektiver Inhibitor des Natrium-Glukose Cotransporters 2, die Glukotoxizität in ZDF Ratten, einem Modell für Typ 2 Diabetes Mellitus, verminderte und dadurch sowohl die Entwicklung einer endothelialen Dysfunktion verhinderte, als auch oxidativen Stress verringerte und anti-entzündlich wirkte. Die Charakterisierung involvierter epigenetischer Mechanismen mittels Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP)-basierter Analyse zeigte einen Effekt von Empagliflozin auf die Expression bestimmter Glukotoxizitäts- und Entzündungsmarker in diabetischen Tieren durch veränderte Histon-Methylierungsmuster. Abschließend wurde das Zusammenspiel von ROS-Entstehung und epigenetischen Veränderungen in H9c2 Kardiomyozyten unter Bedingungen von Doxorubicin-induziertem Kardiotoxizitätsphänotyp analysiert. Dabei wurde festgestellt, dass die Doxorubicin-Behandlung in Korrelation mit erhöhtem oxidativen Stress die Expression bestimmter epigenetischer Modulatoren beeinflusste. Da epigenetische Veränderungen reversibel sind, stellen sie potenzielle Angriffspunkte zur therapeutischen Intervention dar und könnten auch als Biomarker pathologischer Prozesse fungieren. Daher ist ein umfassendes Verständnis des Zusammenwirkens von ROS und epigenetischer Mechanismen in kardiovaskulären Erkrankungen von großem Wert für die Entwicklung neuer und gezielter Behandlungsmöglichkeiten