Andrighetto, A.

Ballan, M.

Caeran, Michele

Corradettia, S.

Di Marco, V.

Marzaro, G.

Realdon, N.

Tosato, M.

Verona, Marco

Italian

CAERAN, MICHELE

VERONA, MARCO

M. Tosato

M. Ballan

S. Corradettia

V. Di Marco

G. Marzaro

A. Andrighetto

N. Realdon

Archivio istituzionale della ricerca - Università di Padova

LinkerTarget secondari di deposizione Chelanti per 111AgSintesi ligandiPROGETTO ISOLPHARM_Ag: PRODUZIONE DI 111Ag E PROGETTAZIONE DI RADIOFARMACI ASCOPO TERAPEUTICOProduzione di 111Ag con metodo ISOLM. Caeranb, M. Veronab, M. Tosatoc, M. Ballana, S. Corradettia, V. Di Marcoc, G. Marzarob, A. Andrighettoa, N. RealdonbIntroduzione ScopoParte sperimentalea INFN, Laboratori Nazionali di Legnaro, Viale dell'Università 2, 35020 Legnaro (PD), Italiab Università degli Studi di Padova, Dipartimento di Scienze del Farmaco, Via Marzolo 5, 35131 Padova, Italiac Università degli Studi di Padova, Dipartimento di Scienze Chimiche, Via Marzolo 1, 35131 Padova, ItaliaI radiofarmaci sono degli strumenti fondamentali aventi un altissimo potenziale nel campo della medicina nucleare. Inbase al nuclide impiegato, i radiofarmaci possono trovare impiego sia nella diagnosi che nella terapia di patologia divaria eziologia. Entrambi i processi sono possibili grazie alla coordinazione del radionuclide ad un ligando in grado diaccumularsi selettivamente sul tessuto d’interesse. La ricerca di nuovi nuclidi e la progettazione dei ligandi, sono adoggi parti fondamentali della ricerca nel settore radiofarmaceutico.La recente cooperazione interdipartimentale tra i laboratori INFN-LNL (Istituto Nazionale di Fisica Nucleare – LaboratoriNazionali di Legnaro), il Dipartimento di Scienze del Farmaco e il dipartimento di Scienze Chimiche è nato il progettoISOLPHARM [1], il quale si pone l’obbiettivo di produrre nuclidi non carrier added, ad elevata purezza isotopica edelevata attività specifica per l’allestimento di radiofarmaci innovativi.Il progetto ISOLPHARM avrà la capacità di produrre un ampio set di n.c.a. radionuclidi per la ricerca nel settoreradiofarmaceutico. I radionuclidi di tale purezza sono altamente richiesti per la radiomarcatura di ligandi per terapia ediagnosi e per la scoperta di nuovi radiofarmaciConclusioni BibliografiaPurificazione di 111AgRadiomarcaturaTra i nuclidi studiati, di grande interesse è 111Ag. Questo radionuclide è un candidatopromettente per la radioterapia grazie alle sue proprietà di decadimento (t1/2 = 7,45 d, energiaβ media 360 keV, penetrazione media dei tessuti di 1,8 mm e bassa percentuale di emissione γassociata) [2]. Lo scopo del progetto ISOLPHARM Ag è quello di sviluppare una facility per laproduzione di 111Ag ad elevata purezza da poter impiegare in ambito farmaceutico.Parallelamente a questo, il progetto ISOLPHARM prevede lo sviluppo di ligandi in grado dilegare stabilmente il nuclide e trasportarlo attivamente su un tessuto target d’interesse.Nel nostro studio è stato preso in considerazione come target il recettore per lacolecistochinina CCK2, il quale risulta sovraespresso in diverse tipologie tumorali di naturaneuroendocrina permettendo quindi una discriminazione tra tessuto sano e tessuto malato[3].L’impiego di 111Ag in ambito medico è possibile coordinando il nuclide in questione con un chelante bifunzionale(BFC), coniugato con un linker a una molecola direzionante in grado di legarsi selettivamente al recettore targetsovraespresso nelle cellule tumorali. Lo sviluppo di nuovi BFC per 111Ag richiede molto lavoro in quanto l'argento (I)è noto come centro metallico altamente labile, quindi i processi di scambio possono verificarsi molto velocemente.Un piccola libreria di chelanti Cyclen derivati, idrosolubili e stabili in acqua sono stati sintetizzati nel nostrolaboratorio e sono attualmente in fase di studio.Ad oggi la facility per la produzione di 111Ag è ancora in fase di costruzione, per questo motive è statonecessario eseguire i primi studi preliminari di radiomarcatura con il 68Ga, nuclide già impiegato nelladiagnostica e facilmente reperibile in commercio. Presso i nostri Iaboratori è stato ottimizzato il processo di radiomarcatura di entrambi I ligandi ottenendoun efficienza finale di marcatura del 90% per entrambi i ligandi.Successivamente è stato ottimizzato il processo di purificazione eliminando così il 68Ga non complessatoottenendo dei radioligandi altamente puri.Pre-purificazionePre-purificazione Post-purificazionePost-purificazioneI ligandi radiomarcati sono stati infine sottoposti a dei test di stabilità in PBS e sangue per determinare la loro stabilità nel tempo. Tali studi hanno evidenziato una grandissima stabilità delle molecole radiomarcate. IP1+PBS 1 oraIP1+PBS 2 oreIP2+PBS 1 oraIP2+PBS 2 oreIP1 in sangue (1 ora)IP2 in sangue (1 ora)In questo studio abbiamo ottimizzato la produzione di argento mediante metodo ISOL intervenendo inparticolar modo sul processo di ionizzazione e deposizione. Questo permetterà la produzione di 111Ag in buonerese quando, presso i laboratori INFN-LNL, sarà possibile operare con fasci di ioni radioattivi. È stato anchevalutato un processo di purificazione preliminare; ulteriori studi sono già in corso nei nostri laboratori pertestare la selettività della resina verso l'argento, al fine di rendere possibile la purificazione dal cadmio. E’ statasintetizzata una piccola libreria di chelanti per 111Ag i quali sono attualmente in fase di studio. Sono statisintetizzati due radioligandi per il targeting attivo di radioisotopi su cellule tumorali sovraesprimenti il CCK2R. Èstato inoltre effettuata la radiomarcatura con 68Ga di entrambi i ligandi e ne è stata valutata la stabilità in PBS esangue a seguito della radiomarcatura.I radioligandi così ottenuti verranno impiegati per dei preliminari studi in vitro e successivamente in vivomediante microPET.Grazie all’applicazione del vuoto (10-6 mbar), ad una temperatura elevata (~ 2000 ° C) e una differenza di potenziale di 25 kV è stato prodotto un fascio di ioni argento. L'efficienza di ionizzazione è stata calcolata monitorando il passaggio di Ag+ nel tempo mediante una Faraday CupEfficienza di ionizzazione[%]Test 1 15,53Test 2 14,83Test 3 14,62I fasci di Ag+ così prodotti sono stati successivamente raccoltisu idonei target secondari costituiti da dischi di NaNO3. Inseguito alla deposizione di Ag+, i target di NaNO3 sono statisciolti in HNO3 0,3 M e analizzati tramite GF-AAS.Poiché la purezza di 111Ag prodotto con il metodo ISOL è influenzata dalla presenza delsuo contaminante isobarico 111Cd, è stato studiato un metodo di purificazione.Basandosi su dati presenti in letteratura, è stata funzionalizzata una silice mesoporosacon un dibenzo-18-crown-6 il quale, presentando una cavità interna di idoneedimensioni, è in grado di solvatare e sequestrare selettivamente l’ Ag presente insoluzione.Una sorgente di plasma ionico è stata collegata al canale el'argento è stato introdotto all'interno della FE sotto formadi nitrato mediante la tecnica del Mass Marker e ionizzato alsuo stato +1A Legnaro i radionuclidi verranno prodotti secondo la tecnica ISOL(Separation Isotope Separation On-Line), che garantisce laproduzione di Rame radioattivi altamente puri (RIB). In breve, ilmetodo ISOL consente la ionizzazione di radioisotopi, prodottiall'interno di un bersaglio primario grazie a un fascio di protoniprimario, che vengono successivamente accelerati e, grazie allaseparazione di massa, purificati per produrre un fascio isobarico [4].I fasci isobarici che contengono un radionuclide utile per lamedicina nucleare possono essere sfruttati per la produzione diprecursori radiofarmaceutici. Ag+ teorico depositato [mg]Ag+ effettivo depositato[mg]Test 1 9,50 6,53Test 2 10,22 7,05Test 3 19,10 12,91Efficienza media di deposizione: 68,44 ± 0,70 % Efficienza media di ionizzazione: 15,03 ± 0,53 % La silice così sintetizzata è stata sottoposta ad uno studio di uptake e rilascio a diverse condizioni per valutare la suacapacità di sequestrare l’argento in soluzione e rilasciarlo in un secondo momento per poterlo così separare dal suocontaminante isobarico 111CdConcentrazione di Ag residuo[mg/L]Efficienza uptake[%]Efficienza rilascio[%]Test 1 0,064 99,68 % 4 %Test 2 0,250 98,75 % 8,22 %Test 3 0,032 99,02 % 1,17 %Test 4 0,142 96,10 % 18,18 %Gli studi eseguiti hanno evidenziato una grande efficienza di uptake da parte della resina ma allostesso tempo una bassa efficienza di rilascio dell’argento. In seguito a questi risultati, sono stateprese in considerazione delle resine di natura polimerica da impiegare nel processo di purificazionele quali sono ora oggetto si studio presso i nostri laboratori.I chelanti sintetizzati sono stati sottoposti aiprimi studi termodinamici per determinarnela stabilità in ambiente acquoso variando lecondizioni sperimentali e per valutare laloro l’affinità verso lo ione Ag+ al variare delpH.Complessi DOT3 – Ag(I) : risultati preliminari pH potenziometriciComplessi DOTETE – Ag(I) : risultati preliminari pH potenziometriciDiagrammi di distibuzione dei complessi DOTETE-Ag(I) in soluzione acquosa di NaNO3 0,15 M a 25 °C1) [Ag]0 = 10-3M, [DOT3]0= 10-3M   (condizioni sperimentali)2) [Ag]0 = 10-7M, [DOT3]0= 10-7M   (condizioni di marcatura)3) [Ag]0 = 10-10M, [DOT3]0= 10-10M   (condizioni in sangue in seguito ad iniezione)Diagrammi di distibuzione dei complessi DOTETE-Ag(I) in soluzione acquosa di NaNO3 0,15 M a 25 °C1) [Ag]0 = 10-3M, [DOTETE]0= 10-3M   (condizioni sperimentali)2) [Ag]0 = 10-7M, [DOTETE]0= 10-7M   (condizioni di marcatura)3) [Ag]0 = 10-10M, [DOTETE]0= 10-10M   (condizioni in sangue in seguito ad iniezione)L'agente direzionante preso in considerazione nel nostrostudio è Z-360, un derivato benzodiazepinico antagonista delCCK2R. Z-360 è stato sintetizzato secondo una procedurapresente in letteratura, con.L'agente direzionante è stato funzionalizzato con due diversilinker ai quali è stato successivamente connesso il chelanteDOTA, necessario per i primi test preliminari di radiomarcaturacon 68Ga. I due ligandi finali IP1 e IP2 sono stati infine purificatie caratterizzati.lievi modifiche per migliorare il processo complessivo. La viasintetica per l’ottenimento di Z-360 prevede prima la formazione delnucleo benzodiazepinico e successivamente la suafunzionalizzazione con gruppi specifici per l’ottenimento dellamolecola finale.[1] Borgna F., Ballan M., Corradetti S., Vettorato E., Monetti A., Rossignoli M., Manzolaro M., Scarpa D., Mazzi U., Realdon N., Andrighetto A., 2017, Appl. Radiat. Isot. 127, 214–226. [2] Vértes A., Nagy S., Klencsar Z., Lovas R.G., Rosch F., 2011, Handbook of Nuclear Chemistry, Second, Springer US, Boston, MA, 2011. doi:10.1007/978-1-4419-0720-2.[3] C. Wayua, P.S. Low, J. Nucl. Med. 56 (2015) 113-119.[4] S. Corradetti, L. Biasetto, M. Manzolaro, D. Scarpa, S. Carturan, A. Andrighetto, G. Prete, J. Vasquez, P. Zanonato, P. Colombo, C.U. Jost, D.W. Stracener, Eur. Phys. J. A. 49 (2013) 56. doi:10.1140/epja/i2013-13056-1.

Progetto Isolpharm_Ag: produzione di 111Ag e progettazione di radiofarmaci a scopo terapeutico

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