Kaschani, F.

Van der Hoorn, R.

MPG.PuRe

Kaschani, Farnusch et al. | Anwendung von activity-based proteomics zur Analyse von ... Tätigkeitsbericht 2006© 2007 Max-Planck-Gesellschaft  www.mpg.de Chemie  Pﬂ anzenforschung  Anwendung von  activity-based proteomics zur Analyse von Pﬂ anzen-Pathogen Interaktionen  Kaschani, Farnusch; Van der Hoorn, Renier  Max-Planck-Institut für Züchtungsforschung ,  Köln  Abteilung - Unabhängige Forschergruppen Korrespondierender Autor Van der Hoorn, Renier, E-Mail: hoorn@mpiz-koeln.mpg.de  Zusammenfassung  Die Aktivität von Enzymen kann in lebenden Organismen durch  activity-based proﬁ ling untersucht werden. Diese Methode nutzt kleine markierte Moleküle, die je nach Aktivität der Enzyme mit diesen reagieren und eine kovalente Bindung eingehen. Die  Plant Chemetics Gruppe entwickelt diese neue Technologie weiter und wendet sie und andere neuartige chemische Werkzeuge an, um die Dynamik von Enzymaktivitäten im Verlauf der Pﬂ anze-Pathogen-Wechselwirkung zu untersuchen.  Abstract  The activities of enzyme classes in a living organism can be displayed by activity-based proﬁ ling. This technology is based on the use of tagged small molecules, which covalently bind to enzymes in an activity-dependent manner. The  Plant Chemetics group is developing and applying this technology and other novel chemistry tools to reveal the dynamics of enzyme activities during plant-pathogen interac-tions.  Protein-Proﬁ lierung Unter Proteinproﬁ lierung versteht man die Bestimmung der relativen Häuﬁ gkeit von Proteinen eines untersuchten Organismus. Mit den Methoden der Proteinproﬁ lierung ist es in der heutigen post Ge-nom-Ära möglich, eine enorme Fülle an Informationen über Genome, Transkriptome und Proteome lebender Organismen zu erhalten und damit verschiedene biologische Prozesse zu beschreiben. Die tatsächliche Aktivität der Proteine/Enzyme lässt sich jedoch nicht ohne weiteres aus ihrer Präsenz ableiten, da sie überwiegend durch post-translationale Prozesse wie Phosphorylierung, Translokation oder durch Prozessierung reguliert wird. Technologien, die in der Lage sind, die Aktivität von Prote-inen zu beschreiben, wie zum Beispiel das  activity-based proﬁ ling , sind deshalb von entscheidender Bedeutung für das tiefergehende Verständnis biologischer Prozesse.  Was versteht man unter  activity-based proﬁ ling ?  Activity-based proﬁ ling ist eine Technik, mit der man die Aktivität einzelner Proteinklassen bestimmen kann. Dazu werden Zellextrakte mit speziﬁ schen, biotinylierten (oder anderweitig markierten) Inhibi-toren inkubiert, die ausschließlich mit aktiven Zielmolekülen reagieren können ( Abb. 1 ) [1].625www.mpg.de © 2007 Max-Planck-Gesellschaft Tätigkeitsbericht 2006 Kaschani, Farnusch et al. | Anwendung von activity-based proteomics zur Analyse von ... Es entsteht eine kovalente, irreversible Bindung zwischen Enzym und markiertem Inhibitor, die die nachfolgende Analyse unter denaturierenden Bedingungen erlaubt (Abb. 1A). Markierte Proteine können gereinigt und auf Proteinblots detektiert werden. Ihre Identität lässt sich durch Massenspekt-rometrie bestimmen. DCG-04 ist ein Paradebeispiel einer auf Aktivität basierenden Sonde (Abb. 1B) und wurde erfolgreich eingesetzt, um die Aktivität von papainähnlichen Cysteinproteasen in Pﬂ anzen zu untersuchen (Abb. 1C) [2].  Abb. 1:  Prinzip des activity-based proﬁ ling.  A Ein biotinylierter Proteaseinhibitor (Sonde) bindet kovalent an die aktiven Enzyme eines Proteoms. Die Bindung ist irreversibel und erleichtert eine nachfolgende Detektion und Isolierung mittels Streptavidin.  B DCG-04: eine auf Aktivität basierende Sonde.  C Zielmoleküle von DCG-04, die aus Blattextrakten von Arabidopsis thaliana isoliert wurden: Blattextrakte wurden mit DCG-04 inkubiert, und anschließend wurden biotinylierte Proteine auf einem Proteinblot mittels Streptavidin-HRP detektiert. Die Identität biotinylierter Proteine wurde durch Massenspektrometrie (Bild rechts) bestimmt. Es wurden nur die Peptide der jeweiligen katalytischen Zentren identiﬁ ziert. SP, Signal Peptid; pro-, Pro-Domäne; aktives Zentrum Cys, Cysteine im aktiven Zentrum, die mit DCG-04 reagieren.  Urheber: Max-Planck-Institut für Züchtungsforschung / Van der Hoorn  Die auf Aktivität basierenden Sonden bestehen aus drei Untereinheiten: einem Inhibitor, einem Ab-standshalter und einem Reporter. Die Inhibitoreinheit leitet sich in den meisten Fällen von speziﬁ schen irreversiblen Inhibitoren ab (im Fall von DCG-04 ist dies E-64). Sie kann aber auch eine reversibel bindende Einheit sein, die mit einer photoreaktiven Gruppe verknüpft ist. Die kovalente Verknüpfung des Inhibitors mit dem Protein (zum Beispiel Metalloprotease) erfolgt dann über eine lichtinduzierte 626Kaschani, Farnusch et al. | Anwendung von activity-based proteomics zur Analyse von ... Tätigkeitsbericht 2006© 2007 Max-Planck-Gesellschaft  www.mpg.deReaktion. Der Abstandshalter schließlich verbindet die Inhibitor- mit der Reportereinheit. Er erhöht so die Speziﬁ tät der Sonde und beeinﬂ usst ihre Löslichkeit. Die Reportereinheit wird für die spätere Analyse beziehungsweise Isolierung der markierten Proteine benötigt. Die Art der Reportereinheit bestimmt wiederum, welche Methode zur Reinigung und Detektion der markierten Proteine verwendet werden muss. Untersuchung „aktiver“ Enzymklassen Aktivitätssonden wurden bereits für viele verschiedene Enzymklassen, insbesondere jedoch für hy-drolytische Enzyme, wie beispielsweise Proteasen, beschrieben [1]. Proteasen katalysieren die Hy-drolyse von Peptidbindungen in Proteinen und können, je nach ihrer evolutionären Abstammung, in unterschiedliche Klane eingeordnet werden. Sonden für papainähnliche Cysteinproteasen (Klan CA), caspaseartige Enzyme (Klan CD) und Proteasom- und ubiquitinartige Proteasen (Klan CE) wurden be-reits entwickelt. Weiterhin sind Photoafﬁ nitätssonden beschrieben worden, mit denen die Aktivität von Metallo- und Aspartatproteasen untersucht werden kann. Darüber hinaus gibt es außerdem eine ganze Reihe von Sonden für die Analyse von Kinasen, Phosphatasen, Glycosidasen und Serinhydrolasen. Die Markierung der Aktivität von Proteasen  in vivo ist den  in vitro -Ansätzen überlegen, da sie direkt in noch lebenden und intakten Zellen durchgeführt wird. Biotinylierte Sonden sind üblicherweise jedoch nicht membranpermeabel, was ihre Anwendbarkeit  in vivo stark einschränkt. Eine Möglichkeit für die Analyse von Proteinaktivitäten in lebenden Zellen ist zum Beispiel der Einsatz permeabler, ﬂ uoreszie-render Sonden, die die subzelluläre Lokalisation von Enzymaktivitäten detektieren können. Eine ver-feinerte Version dieser Sonden ist sogar mit einem intramolekularen Fluoreszenzlöscher verknüpft, der die Fluoreszenz ungebundener Sonden unterbindet. Erst durch die Reaktion mit einer Protease wird der Fluoreszenzlöscher entfernt und die Fluoreszenz wiederhergestellt. Dieser Kunstgriff garantiert, dass das detektierte Fluoreszenzsignal nur durch die Aktivität eines Enzyms hervorgerufen wird. Ein anderer Ansatz, mit dem die  in vivo -Aktivität von Enzymen abgebildet werden kann, macht sich das Konzept der „Click-Chemie“ zunutze. Hier werden Proteine lebender Zellen zuerst mit einem memb-ranpermeablen, chemisch modiﬁ zierten Inhibitor markiert, dann extrahiert und  in vitro unter kontrol-lierten Bedingungen mit einem Reporter versehen. Auch diese Methode konnte für Untersuchungen an Pﬂ anzen erfolgreich adaptiert werden. Sie erlaubt es, nicht nur die Aktivität von Proteinen  in vivo abzubilden, sondern vereinfacht auch die Synthese von neuen Sonden.  Welche biologischen Prozesse können untersucht werden? Prinzipiell kann jeder biologische Prozess mittels  activity-based proﬁ ling untersucht werden. Die Wissenschaftler der Plant-Chemetics-Gruppe wollen genauer verstehen, wie das Pathogen  Pseudomo-nas syringae Pﬂ anzen der Art  Arabidopsis thaliana inﬁ ziert. Während nämlich die Wechselwirkung dieser zwei Organismen auf genetischer Ebene bereits sehr gut verstanden ist, sind Informationen über Enzymaktivitäten spärlich. Die Prozesse, die es einem Pathogen ermöglichen, seine Wirtspﬂ anze zu kolonisieren, sind faszinierend. Um die Abwehrreaktionen der Pﬂ anze zu unterbinden und Nährstoffe zu mobilisieren, programmiert das Pathogen zum Beispiel den Meta- und Katabolismus der Pﬂ anzen-zelle um. Dieser Aspekt der Forschung an der Wirt-Pathogen Interaktion blieb bisher weitgehend un-beachtet, da sich die meisten Forschungsprojekte der Genetik und Molekularbiologie der pﬂ anzlichen Immunität widmeten. Eine ganze Reihe von Indizien spricht dafür, dass Proteasen bei der Wechselwir-kung zwischen Mikroben und Pﬂ anzen eine wichtige Rolle spielen ( Abb. 2 ) [3-5], aber viele Fragen sind noch offen. 627www.mpg.de © 2007 Max-Planck-Gesellschaft Tätigkeitsbericht 2006 Kaschani, Farnusch et al. | Anwendung von activity-based proteomics zur Analyse von ...  Abb. 2:  Proteasen spielen in Pﬂ anzen eine wichtige Rolle bei der Wahrnehmung von Pathogenen (1), bei der Signalweiterleitung während der Abwehrreaktion (2) oder der Grundabwehr (3). Umgekehrt unterdrücken Pa-thogene die Aktivität dieser Pﬂ anzenproteasen durch die Produktion von speziﬁ schen Inhibitoren (4). Außerdem produzieren Pathogene eigene Proteasen, die Nährstoffe aus der Wirtszelle freisetzen (5) oder die die Signalwei-terleitung während der Abwehrreaktion stören (6).  Urheber: Max-Planck-Institut für Züchtungsforschung / Van der Hoorn  Enzyme, die eine veränderte Aktivität während der Infektion von  Arabidopsis durch  Pseudomonas zeigen, werden genau untersucht, um ihre Rolle bei der Pﬂ anze-Pathogen-Wechselwirkung besser zu verstehen. Verschiedene Untersuchungsmethoden kommen dabei zur Anwendung. Der traditionellen reversen Genetik folgend, werden  Arabidopsis knock-out - und Überexpressionslinien mit Pathoge-nen inﬁ ziert und die Unterschiede in den auftretenden Phänotypen bewertet. Diese Pathogen-Assays können auch in  Nicotiana benthamiana Blättern erfolgen, in denen das Transkriptionsniveau endoge-ner Enzyme durch Virus-induzierte Gen-Inaktivierung ( virus-induced gene silencing , VIGS) reduziert wurde. Außerdem wird zielgerichtete chemisch-reverse Genetik angewendet, um die Funktion eines aktiven Enzyms zu bestimmen [6]. Hierbei wird eine von bekannten Inhibitoren abgeleitete Chemika-lien-Bibliothek durchmustert und nach Korrelationen zwischen i.) einem von der Chemikalie verur-sachtem Phänotyp und ii.) der Hemmung einer Enzymaktivität gesucht: Letztere kann durch  activity-based proﬁ ling verfolgt werden. Diese Herangehensweise ist sehr schnell und umgeht gleich mehrere Probleme der traditionellen reversen Genetik, wie zum Beispiel Redundanz und Sterblichkeit. Die Wissenschaftler des Max-Planck-Instituts für Züchtungsforschung hoffen nicht nur, dass diese interdisziplinäre Forschung nützliche chemische Werkzeuge schafft, um biologische Fragestellungen aus völlig neuen Blickwinkeln zu beleuchten, sondern sie sind auch zuversichtlich, dass die intensive Zusammenarbeit zwischen Biologen und Chemikern das generelle Potenzial fachübergreifender For-schung verdeutlicht. 628Kaschani, Farnusch et al. | Anwendung von activity-based proteomics zur Analyse von ... Tätigkeitsbericht 2006© 2007 Max-Planck-Gesellschaft  www.mpg.de Literaturhinweise  [1]  Saghatelian, A.; Cravatt, B. F.:      Assignment of protein function in the postgenomic era.      Nature Chemical Biology  1 , 130-142 (2005)  [2]  Van der Hoorn, R. A. L.; Leeuwenburgh, M. A.; Bogyo, M.; Joosten, M. H. A. J.; Peck, S. C.:      Activity proﬁ ling of papain-like cysteine proteases in plants.      Plant Physiology  135 , 1170-1178 (2004)  [3]  Van der Hoorn, R. A. L.; Jones, J. D. G.:      The plant proteolytic machinery and its role in defence.      Current Opinion in Plant Biology  7 , 400-407 (2004)  [4]  Rooney, H.; Van ’t Klooster, J.; Van der Hoorn, R. A. L.; Joosten, M. H. A. J.; Jones, J. D. G.;      De Wit, P. J. G. M.:       Cladosporium Avr2 inhibits tomato Rcr3 protease required for Cf-2-dependent disease resistance.      Science  308 , 1783-1789 (2005)  [5]  Tian, M.; Win, J.; Song, J.; Van der Hoorn, R.; Van der Knaap, E.; Kamoun, S.:      A  Phytopthora infestans cystatin-like protein interacts with and inhibits a tomato papain-like      apoplastic protease.      Plant Physiology  143 , 364-377 (2007)  [6]  Kaschani, F.; Van der Hoorn, R. A. L.:      Small molecule approaches in plants.      Current Opinion in Chemical Biology  11 , 88-98 (2007) 629

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