Pročišćavanje i karakterizacija ekstracelularne dekstran saharaze iz bakterije Pediococcus pentosaceus, izolirane iz tla sjeveroistočne Indije

Abstract

The extracellular dextransucrase produced from Pediococcus pentosaceus, a new isolate from the soil in Assam, India, was purified and characterized. The enzyme activity of cell-free supernatant was 3.4 U/mL and specific activity was 0.6 U/mg. The crude enzyme was purified by a single-step fractionation using polyethylene glycols of different molecular mass. The specific activity achieved was 18 U/mg with 31-fold purification by PEG 400 and 26 U/mg with 45-fold purification by PEG 1500. The molecular mass of dextransucrase determined by non-denaturing SDS-PAGE was approx. 180 kDa. The dextran formation activity of the enzyme was confirmed by activity staining. Optimum conditions for dextransucrase activity were: pH=5.4, reaction temperature 30 °C, 5 % sucrose and 20 mM sodium acetate buffer. A concentration of 1 mM MgCl2 and 6 mM CaCl2 enhanced dextransucrase activity by 5 and 150 %, respectively. The chaotropic agent urea (7 M) and chelating agent EDTA (1 mM) resulted in the residual enzyme activity of 98 and 80 %, respectively. The organic solvents such as ethanol (50 %), DMSO (90 %), acetone (50 %) and acetonitrile (20 %) decreased the dextransucrase activity by 80, 91, 94 and 80 %, respectively.U radu je pročišćena i okarakterizirana dekstran saharaza iz bakterije Pediococcus pentosaceus, izolirane iz tla u gradu Assamu, Indija. Aktivnost je enzima u supernatantu bila 3,4 U/mL, a njegova je specifična aktivnost iznosila 0,6 U/mg. Sirovi je enzim pročišćen jednostupanjskim frakcioniranjem pomoću polietilen glikola različite molekularne mase. Utvrđena je specifična aktivnost enzima od 18 (pročišćenog 31 put pomoću PEG 400), odnosno 26 U/mg (pročišćenog 45 puta pomoću PEG 1500). Molekularna je masa dekstran saharaze određena pomoću SDS-PAGE, a iznosila je otprilike 180 kDa. Aktivnost je enzima potvrđena bojanjem nastalog dekstrana s Coomasie brilijant plavom bojom. Optimalni su uvjeti za aktivnost enzima bili: pH=5,4; temperatura reakcije od 30 °C; te dodatak 5 %-tne saharoze i acetatnog pufera (20 mM). Dodatak 1 mM MgCl2 i 6 mM CaCl2 povećali su aktivnost enzima za 5, odnosno 150 %. Inaktivirajući agensi, poput uree (7 M) i EDTA (1 mM) smanjili su aktivnost enzima na 98 odnosno 80 %. Organska su otapala također smanjila aktivnost enzima, i to: 50 %-tni etanol na 80 %, 90 %-tni DMSO na 91 %, 50 %-tni aceton na 94 % i 20 %-tni acetonitril na 80 %