Pročišćavanje i karakterizacija bakteriocina proizvedenog s pomoću Bacillus subtilis R75, bakterije izolirane iz fermentiranoga zelenčića (Phaseolus radiatus)

Abstract

Food-grade bacteria capable of producing bacteriocin with desirable preservation attributes have been isolated from traditional Indian fermented food dal vari, which has not been investigated so far. Among different isolates, Bacillus subtilis R75, isolated on MRS agar, exhibited antagonism against a wide range of foodborne pathogens that cause serious spoilage. Extracellularly produced bacteriocin was purified by single step gel exclusion column chromatography. The purity rate and molecular mass of 12 kDa of this compound were determined using SDS-PAGE. Activity units (AU) of bacteriocin were increased in each step of purification, reaching up to 5·10^6 AU/mL. The increase in the activity units directly affected the antimicrobial activity of purified bacteriocin, resulting in an increase up to 200, 333 and 175 % of the inhibition zones against indicator bacteria. Continuous decrease in the number of viable cells of microorganisms within 10 h after adding purified bacteriocin proved its bactericidal action. It withstood very high temperature, up to 121 °C, for 10 min, wider pH range, from 4.0 to 11.0, complete inactivation in the presence of proteolytic enzymes and storage stability up to 2.5 months.Iz dosada neispitanog tradicionalnog indijskog proizvoda dal vari, dobivenog fermentacijom zelenčića (graha mungo), izolirana je bakterija koja proizvodi bakteriocin što proizvod štiti od kvarenja. Od nekoliko ispitanih izolata, bakterija Bacillus subtilis R75, izolirana na MRS agaru, antagonistički je djelovala na različite patogene uzročnike kvarenja hrane. Ekstracelularno proizvedeni bakteriocin pročišćen je gel-filtracijom u jednom koraku. Čistoća i molekularna masa (12 kDa) spoja određeni su SDS-PAGE elektroforezom. Aktivnost bakteriocina povećala se svakom daljnjom fazom pročišćavanja, sve do 5·10^6 AU/mL. Povećanje aktivnosti izravno je utjecalo na antimikrobnu aktivnost pročišćenoga bakteriocina, pa se zona inhibicije rasta bakterija pokazatelja kvarenja povećala za 200, 333 i 175 %. Stalno smanjivanje broja živih stanica mikroorganizama i do 10 sati nakon dodatka pročišćenoga bakteriocina dokazuje njegovo baktericidno djelovanje. Bakteriocin je izdržao vrlo visoke temperature, čak i do 121 °C tijekom 10 min, širi raspon pH-vrijednosti (od 4,0 do 11,0) i potpunu inaktivaciju u prisutnosti proteolitičkih enzima, te je bio stabilan tijekom 2,5 mjeseca skladištenja proizvoda